[发明专利]一种利用CRISPR系统产生多样性抗体文库的方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR系统产生多样性抗体文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建质粒，包括选择性表达含有CRISPR系统的质粒及选择性表达抗体基因的展示质粒；

(2)转化质粒以及阳性克隆的选择，得到含有上述质粒的细胞株；

(3)诱导CRISPR系统对抗体序列的剪切及修复，获得多样性新抗体文库；

(4)诱导新抗体文库的表达及展示；

(5)抗体的富集及高亲和力抗体的筛选。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的选择性表达含CRISPR系统的质粒(简称CRISPR质粒)是指利用四环素系统或其它系统调节CAS9或sgRNA表达的质粒；sgRNA表达质粒根据初始抗体可变区特点设计多个sgRNA靶向序列；所述的选择性表达含有抗体基因的展示质粒是指利用半乳糖诱导或其他诱导抗体基因表达并展示在细胞表面的质粒，选自抗体展示质粒；所述的抗体基因是指Fab抗体、scFv抗体或其它用于筛选抗体的抗体基因序列，选自非免疫抗体文库或诱变后的抗体文库。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的细胞株是指与抗体展示质粒相配套的细胞株；所述的质粒的转化是指将CRISPR质粒及抗体展示质粒转化细胞株，其中根据细胞株选择相应高效的转化方法；所述的阳性克隆的选择根据质粒的筛选标记使用相应的选择性培养基或培养液，筛选得到的细胞株同时含有CRISPR质粒及抗体展示质粒。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的新抗体文库的获得是指通过诱导调控CRISPR系统的开启和关闭，对抗体可变区序列进行剪切，细胞通过NHEJ途径修复后随机形成多样化的突变，形成多样性新抗体文库。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的诱导新抗体文库的表达及展示是指通过诱导抗体展示质粒的表达，使新的多样性抗体展示于细胞表面，用于后续的筛选。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的抗体的富集是指通过蛋白标签或抗原，运用流式或磁珠分选的方法，富集正确展示了抗体蛋白的细胞，去除不能正确表达并展示特异性抗体的细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的高亲和力抗体的筛选是指通过流式或其它抗体筛选方法筛选出高亲和力抗体。