[发明专利]重组人皮肤桥蛋白成熟肽段及其生产方法

权利要求书

1.一种重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备质粒rhDPT/pMD-20T：获得碱基序列如SEQ ID NO.1所示的人DPT基因，将所述人DPT基因连接到pMD-20T载体，得质粒rhDPT/pMD-20T；

(2)构建重组载体pPICZαA/DPT：将pPICZαA原始载体和所述质粒rhDPT/pMD-20T分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，再纯化回收，将回收的pPICZαA载体基因片段与rhDPT基因片段用solution Ⅰ DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA/DPT；

(3)转化重组载体至真核酵母宿主中：将所述重组载体pPICZαA/DPT用Sac Ⅰ单酶切线性化，再转入毕氏酵母X-33宿主中，再经过含zeocin的YPDZ平板筛选得到阳性克隆；

(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：将所述阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性酵母转化子，再用BMGY培养基培养，甲醇诱导，得高水平分泌表达酵母转化子；

(5)纯化：用镍亲和层析柱对rhDPT进行纯化，得重组蛋白rhDPT。

2.根据权利要求1所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，步骤(4)所述高水平分泌表达酵母转化子的筛选的具体方法为：将所述阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性酵母转化子，再用BMGY培养基培养，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞，得细胞液，并调节所述细胞液中甲醇终浓度为0.95-1.05％，诱导70-74h，得高水平分泌表达酵母转化子。

3.根据权利要求2所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，步骤(4)所述的zeocin浓度梯度筛选的具体方法为：将所述阳性克隆转接至含有490-510μg/ml zeocin的YPDZ平板中，筛选到抗性为500μg/ml zeocin的酵母转化子，再将所述酵母转化子用新鲜的YPD液体培养基洗下，经稀释后涂布到含有1490-1510μg/ml zeocin的YPDZ平板中，再将含有1490-1510μg/mL Zeocin的YPDZ平板中生长的酵母转化子经稀释后涂布到含有2990-3010μg/mL Zeocin的YPDZ平板中，筛选得到抗性为3000μg/ml zeocin的高抗性酵母转化子。

4.根据权利要求2所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，步骤(4)所述的诱导的时间为72h。

5.根据权利要求2所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，步骤(4)所述的诱导的温度为28℃-32℃。

6.根据权利要求2所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，步骤(4)所述的诱导的转速为180-220rpm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，步骤(5)所述的纯化的具体方法为：将所述高水平分泌表达酵母转化子进行扩大培养，将培养上清液先用缓冲液A透析，再利用镍亲和层析柱于AKTA-HPLC系统中纯化，即得；所述缓冲液A为含有0.2MNaCl、50mM咪唑、20mM Tris的缓冲液，其pH为8.0。

8.根据权利要求7所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，利用镍亲和层析柱于AKTA-HPLC系统中纯化时，先用缓冲液A漂洗，再利用缓冲液B线性洗脱，收集mAu大于100的洗脱液，即得；所述缓冲液B为含有0.2MNaCl、0.5M咪唑、20mM Tris的缓冲液，其pH为8.0。

9.根据权利要求1-6任一项所述的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段的生产方法，其特征在于，步骤(3)所述的YPDZ平板中zeocin的浓度为95-105μg/ml。

10.一种如权利要求1-9任一项所述的生产方法制得的重组人皮肤桥蛋白成熟肽段。