[发明专利]一种GyV8型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种GyV8新型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法。此发明可直接提供VP3可溶性蛋白作为GyV8诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV8血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白。

背景技术

环形病毒(Gyrovirus)隶属于环状病毒科环形病毒属是一种小型无囊膜二十面体对称的单股环状DNA病毒，大小超过2KB。鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CAV)一直被认为是圆环病毒科(Circoviridae)中环形病毒属(Gyrovirus)唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。2015年，LI等人通过序列非依赖性基因体扩增技术在暴雪鹱组织中发现了GyV8的序列。GyV8属于环形病毒系统发育树第三分支的第一个成员，是第一个来源于其他禽类而非鸡的环形病毒。GyV8基因组为2218bp，(GyV8，GenBank登录号no.KR137527)三个重叠的开放阅读框编码VP1(478-aa)、VP2(232-aa)、VP3(103-aa)，与其他环形病毒的同源性很低，仅其VP1片段有38％-42％的同源性。HGyV的VP3具有和CAV的VP3相似的亚细胞分布模式和细胞凋亡的诱导功能，其诱导细胞凋亡的信号通路也已阐明。然目前尚无检测GyV8抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV8病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV8蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV8在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究GyV8VP3生物学功能具有重要意义。

在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。本发明中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTM II体外重组技术克隆GyV8病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种GyV8型环形病毒VP3蛋白及其制备方法。

本发明所述的GyV8型环形病毒VP3蛋白的制备方法。是利用pGEX-6p-1线性化载体以及GyV8病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。

本发明的方法具体包括以下步骤：

1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体；

上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；

下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。

2)利用下述引物，以pUC57-AV8VP3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因；

上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGTTGCCAGATCTGAC-3’；

下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTAAAAAGGGGTCGATT-3’。

3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP3，阳性克隆经IPTG诱导表达，实现GyV8的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。

本发明的方法中，所述PCR扩增的反应体系为：

40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物,1μl 10ng/μl的pGEX-6p-1质粒或pUC57-AV8VP3质粒，1μl商品化的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶。