[发明专利]一种源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用

说明书

本发明涉及一种源于鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)VP1‑aa 1‑19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用。所述VP1‑aa 1‑19多肽序列如SEQ ID NO.2所示。该多肽可以携带FITC在30min内进入293T细胞、HCT‑116细胞、3T3细胞、MDCK细胞、MSB1细胞，而且穿膜效率与穿膜肽浓度呈正相关性，关键特点其可高效进入悬浮培养细胞。结合激光共聚焦显微镜和流式细胞术结果显示，鸡传染性贫血病毒VP1‑aa 1‑19多肽的穿膜效率明显高于TAT短肽。

技术领域

本发明涉及一种源于鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)VP1-aa 1-19多肽的高效细胞穿膜肽。该多肽可携带FITC在30min内穿入不同的细胞(包括贴壁细胞以及悬浮细胞)。与TAT的比较发现，该多肽对FITC的细胞穿膜功能明显高于TAT。因此，本发明获得的一种源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的高效细胞穿膜肽具有一定的应用前景与价值。

背景技术

细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides，CPPs)是一类可携带生物大分子进入细胞的短肽，长度一般为5-30个富含带正电荷的碱性氨基酸。它不仅自身可以高效的穿过细胞膜进入细胞，还可将不同种类的外源分子例如荧光素、DNA、RNA、蛋白质、量子点等高效携带进入不同物种的细胞。因这种新型的短肽不仅具备传导效率高、生物毒性低、避免激发体内免疫反应、而且穿膜细胞目标广泛和应用灵活的特点，所以是近20年来快速发展的一类新型外源基因或药物传导载体。

根据穿膜肽结构的理化特性，可将其分为阳离子型、两性分子型和疏水型3种。当前阳离子型CPPs的代表TAT短肽是目前研究最热的穿膜肽之一。但TAT短肽包含2个Furin酶识别切割位点(即RKKR和RQRR)，因此TAT在穿膜过程中会被Furin水解而破坏TAT结构，从而减弱其穿膜能力。一种新型、安全高效的细胞穿膜肽有待被挖掘出来。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的安全高效的细胞穿膜肽。

本发明对鸡传染性贫血病毒VP1蛋白N端富含精氨酸序列区(aa 1-60)进行分析设计出具有潜在细胞穿膜功能的多肽(aa 1-19)，经FITC标记后，人工合成。将合成的多肽与不同细胞共孵育，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞术和细胞毒性试验鉴定和验证其穿膜功能和穿膜特性，比较其穿膜效率，并评价其安全性。数据显示，其可携带FITC在30min内穿入不同的细胞，包括悬浮培养细胞。而且经比较研究发现，VP1-aa 1-19多肽的细胞穿膜效率明显高于TAT。

本发明公开了源于鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽作为高效细胞穿膜肽的应用，所述VP1-aa 1-19多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的应用，具体是VP1-aa 1-19多肽经FITC标记后，携带FITC在30min内穿入不同的细胞。所述细胞包括人结肠癌细胞(HCT-116)、小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)、人肾上皮细胞(293T)、犬肾细胞(MDCK)、鸡马立克氏病淋巴瘤细胞(MSB1)。

(1)鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的合成和穿膜功能的鉴定

结合UniProt数据库和在线服务器MultiAlin对不同参考株CAV VP1 N端富含精氨酸区域序列区(aa 1-60)进行比对和分析。根据细胞穿膜肽的特性(富含5-30个正电荷氨基酸)，进行设计与生成拟细胞穿膜肽序列(aa 1-19)。经FITC标记后，人工合成。同时以TAT穿膜肽作为阳性对照。将合成的不同短肽分别与293T细胞、HCT-116细胞、3T3细胞、MDCK细胞、MSB1细胞进行共孵育，利用激光共聚焦显微镜和荧光显微镜鉴定其穿膜功能。

(2)鸡传染性贫血病毒VP1-aa 1-19多肽的穿膜特性与穿膜效率的比较