[发明专利]一种用于TNF‑α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种用于TNF-α检测的半定量核酸适配体试纸条，其特征在于，包括两端分别设有样品垫(2)和吸水垫(5)的底板(1)，底板(1)的中部设置有硝酸纤维素膜检测层(4)；硝酸纤维素膜检测层(4)上靠近吸水垫(5)的一端设有检测线(6)，检测线(6)包被有特异性结合生物素的链霉亲和素；在硝酸纤维素膜检测层(4)和样品垫(2)之间设置有结合垫(3)，结合垫(3)上掺有适配体纳米金复合物；样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)依次搭接；

所述的适配体纳米金复合物是不能通过硝酸纤维素膜检测层的核酸-适配体-纳米金网格状复合物，其中核酸连接在纳米金颗粒上并杂交形成双链，适配体能够与TNF-α特异性识别，在识别后打开双链，使核酸-适配体-纳米金网格状复合物分解；纳米金颗粒上还连接有末端设有生物素的单链核酸，其在适配体纳米金复合物分解后能通过硝酸纤维素膜检测层，并泳动到检测线处。

2.如权利要求1所述的用于TNF-α检测的半定量核酸适配体试纸条，其特征在于，所述的适配体纳米金复合物，是AuNPs-DNA1颗粒和AuNPs-DNA2，3颗粒通过DNA1、DNA2与Linker通过DNA杂交后形成的核酸-适配体-纳米金网格状复合物；

所述的AuNPs-DNA1颗粒是巯基化的DNA1连接于纳米金颗粒上，AuNPs-DNA2，3颗粒是巯基化的DNA2、DNA3分别连接于纳米金颗粒上；

所述的Linker含有与TNF-α特异性结合的适配体序列，且Linker的两端分别与DNA1、DNA2相互补；DNA1、DNA2和Linker可杂交形成双链；DNA3的末端设有生物素，其序列不能与DNA1、DNA2相杂交。

3.如权利要求2所述的用于TNF-α检测的半定量核酸适配体试纸条，其特征在于，所述的DNA1的核苷酸序列为：TCACTTCGCTGAAAAAAA-(CH₃)₃-SH；

所述的DNA2的核苷酸序列为：SH-(CH₃)₆-CTGTATTGTCGC；

所述的Linker的核苷酸序列为：TCCTCCATCCGCGAGTGGGCGACAATACTGTCAGCGTTCACT；其中适配体序列为TGGTCCTAGGCGCAGAGCGCATGTA。

4.如权利要求1或2所述的用于TNF-α检测的半定量核酸适配体试纸条，其特征在于，当样品垫(2)存在TNF-α时，TNF-a特异性结合适配体纳米金复合物，使连接构成适配体纳米金复合物的Linker从其上分离，分离后的带有生物素的颗粒通过硝酸纤维素膜，与检测线上的链霉亲和素结合，从而显示出红色，TNF-α浓度越大，则红色越明显。

5.如权利要求1所述的用于TNF-α检测的半定量核酸适配体试纸条，其特征在于，所述的样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)在相搭接时相互重叠1～3mm。

6.权利要求1所述的用于TNF-α检测的半定量核酸适配体试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

1)利用柠檬酸钠还原法制备出粒径13～20nm的纳米金颗粒；

2)巯基化的DNA1与纳米金经盐老化方法连接形成AuNPs-DNA1颗粒；

巯基化的DNA2、DNA3与纳米金经盐老化方法连接形成AuNPs-DNA2，3颗粒；

3)将AuNPs-DNA1颗粒、AuNPs-DNA2，3颗粒和Linker在缓冲溶液中杂交形成蓝色的适配体纳米金交联复合物；将得到的适配体纳米金交联复合物离心，去除上清，沉淀重悬；

所述的Linker含有与TNF-α特异性结合的适配体序列，且Linker的两端分别与DNA1、DNA2相互补；DNA1、DNA2和Linker可杂交形成双链；DNA3的末端设有生物素，其序列不能与DNA1、DNA2相杂交；

4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴组装到底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分为1～3毫米；

5)将核酸-适配体-纳米金网格状复合物重悬液加于结合垫上，烘干；

6)在硝酸纤维素膜的检测线位置加链霉亲和素溶液，烘干后完成TNF-α检测的半定量核酸适配体试纸条的制备。