[发明专利]一种CAR-T细胞培养流程

权利要求书

1.一种CAR-T细胞培养流程，其特征在于，包括以下步骤：

S10、操作前准备

S101、净化室、生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定；从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温；

S102、生物安全柜表面75％酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。

S20、分离单个核细胞

S201、使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中；

S202、用PBS缓冲液按1∶1稀释外周血，混匀；

S203、将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中；

S204、按照2100r/min的转数，配平离心1200g，离心20min，慢升慢降；

S205、离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层，吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之，小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1∶3，混匀；

S206、按照1600r/min的转数，离心600g，5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数；

S207、按照1200r/min的转数，离心300g，5min，上清液送检无菌检测。

S30、细胞培养

S301、细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4；

S302、根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中，混匀放入CO2培养箱培养2小时；

S303、取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数；

S304、根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1∶3，加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养；

S305、次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒混匀放入CO2培养箱培养；

S306、细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养；

S307、细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养；

S308、定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养；

S309、根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。

S40、CAR-T细胞收集

S401、根据治疗方案，取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输；

S402、细胞悬液转入离心管中，300g离心5min；

S403、除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min；

S404、细胞装袋，离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5％注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。

S50、细胞运输与保存。

2.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养流程，其特征在于，所述S203的具体方法为：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。

3.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养流程，其特征在于，所述S50中，细胞运输保存温度保持在4度左右，运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。

4.如权利要求1所述的一种CAR-T细胞培养流程，其特征在于，所述S304中，加磁珠之前，磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液。