[发明专利]一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用。该功能化温度敏感型聚合物的结构式如式Ⅰ所示，其制备方法包括如下步骤：在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物；温度敏感型聚合物与水合肼经酰肼化反应得到酰肼修饰的温度敏感型聚合物；酰肼修饰的温度敏感型聚合物与2‑(二苯基磷基)对苯二甲酸‑1,1‑甲基‑4‑五氟苯基酯经反应即得。本发明对叠氮标记O‑GlcNAc修饰蛋白质的富集原理是基于叠氮与三苯基磷间的施陶丁格连接反应，此反应生物正交性强，在水溶液中产率高、专一且稳定，同时不需要催化剂从而与后续质谱鉴定具有良好的相容性，该方法大幅度提高了混合样品中低丰度O‑GlcNAc修饰蛋白质谱鉴定的氨基酸序列覆盖率。

技术领域

本发明涉及一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用，属于分析化学领域。

背景技术

O-连接的β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是一种广泛存在于真核细胞中的翻译后修饰。与经典的O-糖基化修饰有所不同，O-GlcNAc糖基化修饰仅存在于细胞核和细胞质蛋白质，只有一个单糖结构，结构简单，是一种高度动态、可诱导且可逆的修饰方式。尽管蛋白质上的这种修饰丰度极低，但O-GlcNAc修饰蛋白质在生物体内扮演着重要角色，从基因转录到信号转导和细胞周期的调控等都有着O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质的参与。研究表明蛋白质上O-GlcNAc糖基化修饰水平异常与许多人类疾病如神经退行性疾病、代谢类疾病及癌症等密切相关。鉴于此，对O-GlcNAc修饰蛋白质进行深度鉴定对疾病的发生发展、疾病诊断标志物的发现及治疗靶标有着深远意义。然而由于O-GlcNAc糖基化修饰处于极低的化学计量水平且O-GlcNAc糖苷键易断裂，对其鉴定手段提出了严峻的挑战。为了提高质谱鉴定灵敏度，在质谱鉴定前在复杂生物样品中对O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质进行富集是必要步骤。近年来国内外发展了针对O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集方法有：凝集素富集法、抗体富集法、酰肼富集法和代谢标签富集法等。凝集素是一种可以与某种特殊结构单糖或聚糖结合的糖蛋白，因此可利用凝集素与糖链间的亲和作用富集糖蛋白/糖肽。但其亲和力不足、选择性有限且偏爱簇生的GlcNAc修饰，因此富集效率低。抗体富集法是基于抗体抗原的特异性结合进行选择性富集。目前已商业化的O-GlcNAc修饰的抗体中使用较多的是RL2和CTD110.6，此方法的特异性和富集效率都强于凝集素富集法，但抗体存在底物氨基酸序列依赖性且制备周期长、价格昂贵而难以广谱性富集所有的O-GlcNAc修饰蛋白/肽段。酰肼富集法是利用氧化剂将O-GlcNAc糖链上相邻的两个羟基氧化形成醛基再利用其与带有酰肼基团的固相载体共价结合选择性富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段，但此方法需要进行多步化学反应，且氧化后糖链开环使得糖链结构不能完整保留，影响下游对糖链的结构解析。代谢标签富集法通过细胞代谢标记在O-GlcNAc修饰上引入叠氮等修饰基团再利用生物正交反应选择性富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段。此外，现有O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集载体均为固相材料，在富集时与溶液中的靶分子蛋白形成异相体系，固液界面间的传质阻力和固相材料与目标蛋白间的空间位阻等因素都会降低富集反应速率和效率。因此需要提供一种新的富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用，本发明通过自由基聚合反应和化学修饰的方式(三苯基磷基团修饰)制备得到功能化温度敏感型聚合物，能够实现选择性富集、分离O-GlcNAc修饰蛋白质，然后即可利用质谱技术分析鉴定O-GlcNAc修饰蛋白样品。

本发明所提供的功能化温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，m为40～280之间的数，n为140～850之间的数。

所述功能化温度敏感型聚合物的数均分子量可为20000～120000，优选50000～60000。

式Ⅰ中，m优选为110～140之间的数，n优选为350～420之间的数。