[发明专利]家蝇酚氧化酶原激活酶1基因及其重组蛋白与应用

权利要求书

1.一种家蝇酚氧化酶原激活酶1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的家蝇酚氧化酶原激活酶1基因，其特征在于，其编码的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求1或2所述的家蝇酚氧化酶原激活酶1基因的克隆方法，其特征在于，

（1）总RNA的提取：常规方法提取家蝇总RNA；

（2）cDNA第一链合成：利用Smart F、Oligoanchor R作为反转录的引物，先配成12 μL体系:

总RNA 5μg 10 μL，

Smart F 100μM 1μL，

Oligoanchor R 100μM 1μL；

混合均匀，瞬时离心；70℃水浴5 min，冰浴2 min，向以上体系中继续加入其他组分：

5×First－Srand Reaction Buffer 4μL，

RNase inhibitor 20u/mL1μL，

dNTP Mix 10mM 2μL；

轻轻混匀，瞬时离心；37℃水浴5 min；

加200U/mL 1 μL反转录酶SupermoⅢ M-MLV ，至终体积20 μL；轻轻混匀，瞬时离心，50℃水浴60 min；

70℃水浴5 min，冰浴2 min，终止第一链cDNA合成；

（3）PCR反应：依据家蝇转录组测序获得的Unigene序列设计特异引物3’端扩增-F与3’anchor R；

25 μL PCR反应液配制方案：

灭菌水 18.4μL，

10×Taq Buffer 2.5μL，

dNTP Mix 2.5mM 2.0μL，

3’anchor R 10μM0.5μL，

3’端扩增-F 10μM0.5μL，

Taq 5U/μL0.1 μL，

cDNA模板 1.0μL；

混匀以上PCR反应液，置于PCR仪上，PCR反应条件：94℃ 2 min，进入以下循环：94℃30 sec；55℃，30 sec；72℃，80 sec；重复30次后，72℃延伸10 min；

（4）PCR产物纯化：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切出目标带，用胶回收试剂盒进行纯化；

（5）mdPAP1基因cDNA克隆：将纯化产物连入T载体pMD-19-T，构建重组质粒；反应液及用量为：

纯化PCR产物4μL ，

2×ligation buffer 5μL，

pMD-19-T 载体1μL；

混匀反应液，16℃过夜连接；转化感受态细胞DH5α，在含100µg/mL氨苄青霉素、0.2µg/mL X-gal、0.1mol/mL IP TG LB平板上37℃过夜培养；从转化板上挑取白色克隆，经PCR检测阳性后，接种于含有100 mg/mL氨苄青霉素的5mL LB试管中，37℃，250 rpm过夜振荡培养，10000 rpm离心菌液3 min，留细胞，用微量DNA提取试剂盒提取质粒，测序，将所得序列与基因库序列比较，确定扩增的该基因的3‘端序列正确；

将扩增的该基因的3‘端序列与Unigene序列拼接一起，就获得了SEQ ID NO.1所示mdPAP1基因全长cDNA的核苷酸序列；

所述Smart F的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述Oligoanchor R的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述3’端扩增-F的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述3’anchor R的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述Unigene的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.家蝇酚氧化酶原激活酶1基因在制备免疫性药物中的应用。

5.家蝇酚氧化酶原激活酶1基因表达的重组蛋白在激活MdproPO的酶活性中的应用。