[发明专利]提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法

说明书

本发明公开了提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法。发明人通过大量的研究，发现通过富集母体外周血中的<160bp的某一点或者任一区段长度的游离DNA进行测序和数据分析，可以出人意料地富集母体外周血中胎儿的游离DNA，从而将胎儿游离DNA浓度(百分比)提高至原来的1.5～4倍。孕妇外周血中胎儿游离DNA的浓度均值为13％，本发明的装置和方法可将胎儿游离DNA浓度均值提高至20％～40％，效果显著。通过有效提高胎儿游离DNA浓度，可以大幅减少高通量测序的数据处理量，有利于进一步降低高通量测序的成本。

技术领域

本发明涉及一种含有游离DNA样本的前处理试剂盒、装置及方法，特别涉及一种提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法。

背景技术

胎儿染色体异常(包括染色体非整倍体异常以及微缺失微重复异常)导致的出生缺陷发生率约1％，染色体异常主要指染色体数目和结构异常，包括21-三体综合征(T21)、18-三体综合征(T18)、13-三体综合征(T13)、XO综合征、XXX综合征、XYY综合征和XXY综合征以及各种染色体微缺失微重复综合征。患儿多表现为智力障碍、发育迟缓、多发畸形或成年后生育障碍等。

单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，据人类在线孟德尔遗传数据库统计，目前有6000多种单基因遗传病，对致病机理及分子机制研究清楚的大致有3700多种。常见的单基因遗传病有G6PD缺乏症(蚕豆病)，地中海贫血症，假肥大性肌营养不良(DMD)，耳聋、白内障等。

对胎儿基因组异常的产前诊断是降低出生缺陷、提高出生人口素质的重要手段。传统的羊膜腔穿刺、绒毛活检、脐静脉穿刺等方法准确性高，但均为侵入性的，伴随0.2％～0.5％的流产和感染风险[1]。同时，这些侵入性的检测方法对操作者的经验要求较高，会在母体上留下创口，对母体的形态有一定的影响，随着技术的发展，使用率已经大幅降低。

1997年，lo等人[2]发现在母体外周血中存在胎儿的游离DNA，为通过母体外周血进行无创胎儿基因组异常奠定理论基础。2008年，Lo[3]和Stephen quake[4]宣布通过高通量测序检测母体外周血的游离DNA可筛查胎儿染色体非整倍体异常，开创了无创胎儿染色体非整倍体基因检测(NIPT)的新方法。

CN102108409A基于其发现母体血浆中的胚胎DNA大部分为100bp到250bp的片段，且各个染色体占总DNA的比例与各个染色体占母体血浆中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA的比例是一致的，通过测定100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA的每段DNA来自几号染色体，并计算在同一样本内100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据变异的数值确定待测染色体的拷贝数。这一方法只是基于阳性样本不同长度bins的游离DNA ratio值存在差异进行染色体非整倍体检测，并不能提高胎儿游离DNA的浓度，其准确性依然受到血浆中胎儿游离DNA实际浓度的限制。

据2015年统计，NIPT对T21、T18和T13的综合检出率为99％，假阳性率低于0.5％，准确性接近有创产前诊断水平。NIPT由于检测通量大、灵敏度和特异性很高，目前已被广泛应用于临床的胎儿染色体非整倍体筛查[5]。随后，母体外周血游离DNA还被证实可用于检测胎儿的微缺失和微重复综合征[6]以及胎儿单基因病[7]。但是，无创胎儿微缺失微重复综合症的准确性远远低于NIPT，灵敏性只有70％～90％，其检出的准确性受胎儿游离DNA浓度、微缺失微重复区域的长度以及测序数据量的影响。