[发明专利]一种高性能M‑MLV逆转录酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物催化剂的制备方法，特别是一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法。

背景技术

现代生物医学建立在分子生物学“中心法则”的基础之上。通过基因表达研究基因功能是现代生物医学的核心问题之一。由于基因表达产物RNA极易降解，因此绝大多数关于基因表达的研究都需要将RNA逆转录为cDNA来作为研究对象。特别是近年来，伴随着高通量测序技术的飞速发展，RNA测序在生物医学前沿研究中得到了广泛的应用，在真核生物的基因表达调控研究、疾病发生机制研究和精准医疗方案确定、动植物遗传育种等众多方面都具有不可估量的潜力。而RNA测序同样需要首先将模板RNA转变为cDNA来构建测序文库。在这些过程中，都需要一种极为重要的生物催化剂——逆转录酶。

逆转录酶（Reverse Transcriptase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成cDNA的酶。逆转录酶具有3种活性：RNA指导的DNA聚合酶活性，DNA指导的DNA聚合酶活性（这2种活性共用同一个活性中心），以及降解RNA-DNA杂合链中RNA的RNase H活性。在生物医学领域，逆转录酶被广泛用于合成第一链cDNA、制备cDNA文库、RNA测序等。为此，最早发现逆转录酶的美国科学家特明（H. M. Temin）和巴尔的摩（D. Baltimore）共同获得了1970年诺贝尔生理学或医学奖。

合成cDNA的最大挑战在于，在较低的温度下单链RNA容易自身配对形成发夹等复杂二级结构，阻碍逆转录反应的进行；同时，逆转录酶自身具有的RNase H活性会降解模板RNA，导致合成的cDNA被截短。而较高的温度能够打开RNA的二级结构，有利于cDNA的合成。目前，人们仍然缺乏高效率热稳定性逆转录酶作为工具，因此，寻找热稳定性更高的逆转录酶，或者改造提升现在已经发现的逆转录酶的热稳定性十分重要。

最常用于生物医学工具酶的逆转录酶包括莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia virus，M-MLV）逆转录酶和禽骨髓母细胞瘤病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）逆转录酶。M-MLV逆转录酶由一条多肽链构成，包括N端聚合酶结构域和C端RNase H结构域，一般在37°C -42°C下工作，在高温下会很快失活。AMV逆转录酶具有更高的最适反应温度（45°C -50°C），但由于和M-MLV逆转录酶相比，其cDNA合成效率较低、RNase H活性较强，所以应用范围较小。由于野生型M-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶在反应温度方面受限，科研人员对于它们的热稳定性和cDNA合成效率的提升改造从未间断。其中一个有效的改造是通过点突变将它们的RNase H活性去除。去除RNase H活性后，它们对于全长cDNA的合成有了很大改善，热稳定性也有了一定提高。M-MLV逆转录酶由单体构成，结构比AMV逆转录酶（由2个亚基构成）更为简单，因此也得到更多的改造尝试。通过分子设计结合高通量筛选的方法，目前已获得了热稳定性高达60°C的M-MLV逆转录酶突变体。

在野生型M-MLV逆转录酶中引入大量随机突变，并使用compartmentalized ribosome display (CRD) evolution in vitro technique技术进行高通量筛选，选出热稳定性提升的突变体。现有报道的最高热稳定性M-MLV逆转录酶耐热能力为60°C。其缺陷在于：由于突变是随机引入的，导致无效突变或失活突变过多，后期筛选工作量大且命中率低。筛选使用的compartmentalized ribosome display (CRD) evolution in vitro technique技术要使用无细胞表达体系，价格昂贵。现有报道的最高热稳定性M-MLV逆转录酶耐热能力为60°C，耐热能力较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分子理性设计与功能筛选相结合从而获取高热稳定性的M-MLV逆转录酶的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种高性能M-MLV逆转录酶的制备方法，其特点是，其步骤如下：