[发明专利]一种猪细小病毒毒株及其应用

说明书

本发明公开一种猪细小病毒毒株及其应用，属于疫苗领域。该病毒是从广东地区采集并分离得到的，经鉴定，命名为猪细小病毒PPVGD株，于2016年03月18日保藏于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：V201618。其全基因序列如SEQ ID NO：1所示。将PPVGD株制备的灭活疫苗接种豚鼠后，28d后，测HI抗体效价的几何平均为1：194；接种四月龄的猪细小病毒抗体阴性的猪，在免疫28d后，测HI，抗体效价的几何平均约为1：147。可知，本发明表明了以广东分离株PPVGD株制备的灭活疫苗接种豚鼠和后备母猪后具有良好的免疫原性，且略高于商品化的灭活疫苗。

技术领域

本发明属于疫苗领域，涉及一种猪细小病毒毒株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用。特别涉及一株自行分离得到的PPVGD株以及由该毒株制备的灭活疫苗。

背景技术

猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)为引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，可引起胚胎或胎儿的感染和死亡，导致母猪发生流产、死胎、木乃伊胎及新生仔猪的死亡，而母体通常缺乏临诊症状。猪细小病毒是由Mayr等人于1966年进行猪瘟病毒组织培养时首次发现的，于1967年，Cartwright等人首次证明了它的致病作用。在我国，潘雪珠于1983年首次分离到猪细小病毒。此后，在全国各地陆续分离到数株猪细小病毒毒株。目前，人们发现猪细小病毒常与猪瘟病毒、猪圆环病毒等混合感染给猪养殖业带来严重的危害，导致断奶仔猪多系统综合征、皮炎等，所以对猪细小病毒进行研究依然很迫切。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种猪细小病毒毒株。

本发明的另一目的在于提供所述的猪细小病毒毒株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明是采用PCR方法对广东地区采集的疑似PPV病料进行PCR检测，经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪细小病毒(PPV)，采用猪睾丸(ST)细胞分离培养，培育1株ST传代细胞培养适应毒株，命名为PPVGD株。通过观察细胞病变、生物学特性研究等途径证实分离的病毒为猪细小病毒。

一种猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)，命名为猪细小病毒PPVGD株，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年03月18日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201618。

本发明将设计扩增PPVGD株全部结构基因序列的5对引物，通过梯度PCR得出引物最佳的退火温度。经过PCR扩增、胶回收、加polyA、连接T载体、转化、提取质粒等过程，送公司测序，通过拼接得到PPVGD株全部结构基因序列。

所述的猪细小病毒PPVGD株全部结构基因序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的猪细小病毒PPVGD株的繁殖方法，包括如下步骤：

当ST细胞长至60％左右时，弃去培养液，用PBS清洗3次后，加少量DMEM，然后按2％的接毒量接种于ST细胞，轻轻摇动，使病毒液充分均匀的分布于培养液中，置于5％CO₂、37℃温箱中孵育1h后，补加培养液，使血清的终浓度为2％，设空白对照组。逐日观察细胞病变情况，当细胞病变达80％左右时，约在接毒后的48～72h左右，反复冻融三次，收获病毒，放于-80℃备用。

所述的猪细小病毒PPVGD株在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用。

一种猪细小病毒灭活疫苗，含有灭活后的上述猪细小病毒PPVGD株。

本发明将猪细小病毒PPVGD株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂；

所述的油乳剂优选为白油乳剂；