[发明专利]南瓜未授精子房离体培养诱导雌核发育的培养基及应用

说明书

技术领域

本发明涉及农业技术领域，尤其是一种南瓜未授精子房离体培养诱导雌核发育的培养基及应用。

背景技术

南瓜(Cucurbita moschata)是葫芦科重要的蔬菜作物之一,具有丰富的营养和保健功能，具有“世界性蔬菜”的美称。尽管我国南瓜种质资源十分丰富,但其杂交育种工作相对滞后,主要是新种质创制，农艺性状遗传机制和分子标记辅助育种等相对滞后。选育杂交新品种需培育高纯度的亲本自交系，但传统的人工自交选择耗时长(5-8年)，费工多,且亲本性状的表现常受环境的影响,选择难度大。而在离体条件下,培养未授精子房诱导雌核发育是葫芦科蔬菜获得单倍体植株的途径之一,单倍体植株自然加倍或人工加倍后获得的双单倍体植株理论上完全纯合，这一过程只需要1-2年时间，大大缩短了亲本纯化的周期，提高选择效率；双单倍体还是遗传分析及分子标记的优良材料。故加强南瓜单倍体创制是提高杂交育种效率的重要工作，但南瓜离体雌核发育的研究报道较少，技术不成熟，严重制约了单倍体育种技术的应用。

发明内容

本发明的目的是：提供了一种南瓜未授精子房离体培养诱导雌核发育的培养基及应用，它能不经过细胞愈伤化直接获得南瓜植株，且成本低廉，安全有效，培养过程简单，易于操作，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：南瓜未授精子房离体培养诱导雌核发育的培养基，以MS培养基为基础，包括0.06mg/L植物生长调节剂TDZ，3％蔗糖及7％琼脂，PH为6.0。

采用上述培养基进行南瓜未受精子房离体培养诱导雌核发育获得南瓜再生植株的方法，包括如下步骤：

1)取南瓜开花前1天的雌花，在2-5℃下冷藏预处理24-48小时；

2)将完整的子房在超净台上用质量百分比浓度为75％的酒精消毒1min，再用质量百分比浓度为0.1％的升汞消毒10min，用无菌水清洗干净后，将南瓜子房切成1-1.5mm厚的子房片接种在所述的培养基上；

3)在30-35℃下黑暗培养4-7天后，转入20-28℃下培养3个月，光照16h，黑夜8h，光照强度为3000lx。

所述植物生长调节剂TDZ的化学名称为1-苯基-3-(1,2,3-噻二唑-5-基)脲。

本发明利用植物未授精子房(大孢子)离体诱导产生单倍体植株，再使染色体组加倍，从而使植物恢复正常染色体数。

与现有的技术相比，本发明对MS培养基进行了优化，在培养基中中附加了一定浓度的TDZ，利用该培养基对南瓜子房片进行培养，在培养3个月后，能直接获得再生植株。解决了现有技术采用诱导瓜类蔬菜雌核发育需要进行预处理、多次转接、多种植物激素配合使用，而造成费力费时且成本高的问题。本发明有效减少了转接次数，降低了成本，为南瓜单倍体育种提供简单的技术方法。还可用于其它瓜类蔬菜诱导雌核发育形成再植株。所采用的TDZ成本低廉，安全有效，培养过程简单，易于操作。本发明简单易行，使用效果好。

具体实施方式

本发明的实施例：试验地点：贵州省园艺研究所蔬菜遗传育种实验室，重复试验2次。

试验时间：2016年1月-2016年11月

实施方案：

1)取南瓜开花前1天的雌花用冰盒带回实验室，自来水冲洗10分钟，擦干后置于4℃冰箱预处理24-48小时；

2)将完整子房在超净台用75％的酒精消毒1min，再用0.1％的升汞消毒10min，无菌水洗3次，切成1mm子房片接种在6个不同处理的培养基上；

处理1：MS+3％蔗糖+琼脂7％，PH6.0。

处理2：MS+3％蔗糖+琼脂7％，附加TDZ0.02mg/L，PH6.0。

处理3：MS+3％蔗糖+琼脂7％，附加TDZ0.04mg/L，PH6.0。

处理4：MS+3％蔗糖+琼脂7％，附加TDZ0.06mg/L，PH6.0。

处理5：MS+3％蔗糖+琼脂7％，附加TDZ0.08mg/L，PH6.0。

处理6：MS+3％蔗糖+琼脂7％，附加TDZ0.1mg/L，PH6.0。

3)33℃黑暗培养5天后转入25℃(光强3000lx，光照16h，黑夜8h)培养3个月，获得的培养结果如表1所示。

表1培养基中添加不同浓度TDZ对植株再生的影响

从表1中可以看出，以处理1为对照，处理3、处理4、处理5都能获得植株，当TDZ浓度为0.06mg/L时，直接形成植株，效果较好，植株再生率为9.5％。处理3与处理5在培养过程中先形成胚，胚愈伤化后再分化成苗，从培养到成苗需要5-6个月，植株再生率分别为1％、1.5％。处理1、处理2培养3个月后褐化死亡，处理6因为TDZ浓度过高，其它组织全部愈伤化，不能形成植株。可见，TDZ浓度对于效果有非常重要的影响。