[发明专利]免疫诊断急性肝胰腺坏死综合症的蛋白卵黄抗体及其制备工艺和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程与水产疫病检测技术领域，具体涉及一种抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体、其制备方法及应用。

背景技术

自2009年以来，早期死亡综合症(EMS)，又称急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)给亚洲，特别是东南亚和中国的对虾养殖产业造成了前所未有的冲击。除了大规模减产外，该疾病还带来了诸多负面问题，例如：对虾养殖就业问题、社会福利问题、对虾供求问题和全球对虾总体价格问题等等。

2013年5月，美国亚利桑那大学水产病理实验室(UAZ-APL)定义急性肝胰腺坏死综合症(AHPNS)病原为副溶血弧菌的特异菌株，该菌株能够产生毒素并诱导健康对虾致病。2014年，在世界范围内普遍证实目前APHND的病因与副溶血弧菌所携带的毒素质粒所表达的PirA和PirB两种毒素相关。

目前针对该疾病的诊断集中在对毒素质粒的基因检测。现阶段已出现了一种商业化的基因检测试剂盒和三种通过基础研究得出的不同引物设计得到的诊断方法。

CN 103667498 A公开了副溶血性弧菌的检测方法。所述方法用于副溶血性弧菌检测的特异性引物是根据副溶血性弧菌种特异性基因tlh的保守区域所设计的一对外围引物、一对交叉引物和一对特异性检测探针；副溶血性弧菌种特异性基因tlh是编码副溶血性弧菌不耐热溶血毒素TLH的毒力基因。检测方法：副溶血性弧菌模板DNA的提取；外围引物的验证；交叉引物恒温扩增反应体系的建立；交叉引物恒温扩增程序；扩增产物的检测。CN 102747148 A公开一种副溶血性弧菌检测用引物组，包括下列引物：F3引物：GACGTACCATGTACTAGATC；B3引物：GCCATCACTAGCCATAGCG；FIP引物：CGATCGCCAGCATGCGCGGCATGTCTATTGGTGAGAGGTCTTG；BIP引物：CATGATTTCAATGACGTCCCATTCTGAACCCAAAATCCGGGC。该发明还提供一种使用上述引物组检测副溶血性弧菌的方法。

现阶段的诊断方法存在的不足之处主要在三个方面：(1)基因诊断需要PCR仪器以及复杂的操作过程，且时间一般在4个小时以上，不利于基层以及现场对疫情的快速诊断。而且目前该诊断方法在国内还没有商品化的产品，全球范围内的三种基因检测方法均由国外提供，其中一种已得到商品化。(2)基因诊断只能检测是否存在毒素表达基因，并不能诊断出毒素是否得以表达。而急性肝胰腺坏死综合症得根本原因是表达的毒素蛋白对机体的损伤，因此只有检测毒素蛋白才能更准确地判断疫病的爆发，减少假阳性。(3)目前的基因诊断技术只有95％的准确性，还有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供免疫诊断急性肝胰腺坏死综合症的蛋白卵黄抗体及其制备工艺和应用。能够对急性肝胰腺坏死综合症这类疾病的防治及检测提供了首创的免疫诊断技术。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体，以pirA和pirB蛋白作为抗原免疫产蛋禽类，并从其卵黄中提取，能够与所述pirA和pirB蛋白特异性结合。

本发明的pirA和pirB蛋白可以通过在适当的宿主中表达得到，也可以通过常规肽合成技术化学合成得到，优选的是在适当的宿主中表达得到。

本发明中，所述的pirA和pirB作为一种毒素蛋白，通过基因工程手段从副溶血弧菌中获得，作为一种特异性可产生特异性抗体的蛋白，其产生的抗体具有抗急性肝胰腺坏死综合症，相比于直接用副溶血弧菌直接免疫产生抗体，以pirA和pirB蛋白免疫产生的抗体，专一性更强，效果更好；除此之外，通过pirA和pirB免疫产蛋禽类产生的卵黄抗体，相较于别的抗体，抗性更强，效率更高。

优选地，所述pirA蛋白含有111个氨基酸。

优选地，所述pirA蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示片段，所述序列如下：

优选地，所述pirB蛋白含有438个氨基酸。

优选地，所述pirB蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示片段，所述序列如下：

第二方面，本发明还提供一种如第一方面所述的抗急性肝胰腺坏死综合症毒素蛋白卵黄抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备所述pirA和pirB蛋白抗原；

(2)使用所述pirA和pirB蛋白抗原及佐剂，对产蛋禽类进行注射免疫，检取免疫禽类所产的免疫蛋；