[发明专利]骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用及其试验方法

权利要求书

1.一种骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用，其特征在于：该种外分泌体用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤细胞的药物敏感性。

2.一种用于验证如权利要求1所述的应用的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）外分泌体的提取

1.1）血清去除外分泌体：血清用超速离心机在4℃条件下，100000xg离心2h，去除沉淀，然后取上清用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的无外分泌体的血清，抽滤完成后于4℃保存备用；

1.2）细胞用含有10%无外分泌体血清的培养基培养，培养24~72h后可用于提取细胞分泌到细胞外液中的外分泌体；

1.3）16%PEG储存液的制备：称取5.944g氯化钠和16g PEG8000，溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌器搅拌溶解完成后用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的16%PEG储存液，4℃保存备用；

1.4）取步骤1.2）中由含10%无外分泌体血清的培养基培养的细胞悬液于15ml离心管中，1000rpm离心5min，去除细胞；

1.5）然后转移步骤1.4）中15ml离心管内的上清于一支15ml离心管中，3000rpm~4000rpm离心30min，去除细胞碎屑及大的囊泡；

1.6）接着吸取步骤1.5）中15ml离心管内的上清于另一支15ml离心管中，加入等体积的16%PEG储存液，使得PEG的工作浓度达到8%，4℃过夜孵育，使其聚集沉降；

1.7）次日，将步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

2）外分泌体的定量

2.1）取步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液1ml，于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

2.2）向步骤2.1）中提取到的外分泌体中加入100ul 1×细胞裂解液，超声波破碎仪破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法测定浓度，即可知道1ml细胞上清和PEG混合液中可提取的外分泌体的量；

2.3）根据比例，取不同体积同批次的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，即可得到不同量的外分泌体，用于后续的细胞活性实验；

3）外分泌体活性实验

3.1）按照步骤2）的方法提取出不同量的外分泌体；

3.2）铺板5×105骨髓瘤细胞于96孔细胞板中，加入不同量的外分泌体；

3.3）培养一段时间后，于每孔中加入对骨髓瘤半致死浓度的咔菲佐米，37℃，5%CO2条件下培养3~4天；

3.4）然后于每孔中加入10ul CCK8，37℃，5%CO2条件下培养1~2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。