[发明专利]一种春兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法

权利要求书

1.一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，从春兰新生长的假鳞茎上剥取茎尖，将其置于VW培养基辅以0.5～1mg/L 6-苄基腺嘌呤的原球茎诱导培养基表面培养成原球茎，将原球茎进行反复切割和继代培养，所采用的继代培养基为VW培养基辅以0.2～0.4mg/L 6-苄基腺嘌呤，从而繁殖出所需数量的原球茎，然后采用VW培养基辅以2.5mg/L多效唑的离体保存培养基进行培养，待原球茎进入发育生长阶段后，在0～5℃条件下暗培养。

2.根据权利要求1所述的一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，所述茎尖的剥取方法如下：选择长度为5～7cm的假鳞茎，用自来水清洗表面尘土，剥去最外层的1～2个叶片，用体积浓度75%的酒精擦洗3～4秒，放入质量浓度0.1%的升汞溶液中灭菌20分钟，无菌水冲洗3～4次，晾干或用滤纸吸干表面水分，在显微镜下剥取大小约为0.5mm的茎尖。

3.根据权利要求1所述的一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，将茎尖置于试管或培养瓶中原球茎诱导培养基的表面，轻压茎尖以接触到原球茎诱导培养基的表面为宜，避免埋入，进而引起窒息死亡，及时密封并做好标记。

4.根据权利要求1所述的一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，原球茎的培养方法是：将茎尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养15天后，出现明显膨大，30天后出现若干个白色突起，45天后，所述突起体积增大形成原球茎。

5.根据权利要求1所述的一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，反复切割和继代培养的具体方法是：将生长为4～6mg的原球茎切割成4块，然后置于继代培养基中继续扩增培养，建立无性繁殖系，反复切割和继代培养，从而短时间繁殖出所需数量的原球茎。

6.根据权利要求1所述的一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，所述发育生长阶段是选择发育健壮、大小均匀的原球茎，置于离体保存培养基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养7天。

7.根据权利要求1所述的一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，暗培养阶段应当定期观察生长情况，随时剔除有污染的培养瓶。

8.根据权利要求1所述的一种春兰种质资源离体保存方法，其特征在于，暗培养阶段所使用的离体保存培养基，厚度约为4cm，并且，用于放置离体保存培养基的试管或培养瓶应当密闭良好，以减少离体保存培养基中水分的挥发。

9.权利要求1～8所述离体保存方法保存后恢复生长的方法，其特征在于，将暗培养中的原球茎转移至分化培养基上，由原球茎分化产生幼苗；所述分化培养基为KC培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁，培养温度25℃，光照强度2000lux，每天光照时间为10小时。

10.根据权利要求9所述的保存后恢复生长的方法，其特征在于，原球茎在分化培养基上接种30天后，在原球茎顶端部分出现由叶原基发育成的幼叶，随后幼叶迅速生长，待出现第2～3片叶时，原球茎向下伸长，并且有第1条根生出；50天后，等到幼苗有2～3条根，5～6片叶，生长到10cm左右，发育成完整的植株，将试管苗移栽在育苗基质中，在自然条件下生长成正常植株。