[发明专利]一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用PBS冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm²小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的IV型胶原酶的低糖基础培养基中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；

步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lOmin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)；

步骤三：将2L去离子水烧热至沸腾，加入4g碳酸钠及5g家蚕生丝，煮沸30min后，用去离子水清洗干净并烘干，再用9.3mol/L的LiBr溶液溶解蚕丝，溶解浓度20wt％，待完全溶解后将溶液装入透析袋，去离子水透析72h，9000r/min离心20min，重复两次，得丝素蛋白溶液；

步骤四：将丝素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然风干后获得丝素蛋白膜；

步骤五：将丝素蛋白膜溶于质量浓度98％甲酸中，然后装入注射器中进行静电纺丝，纺丝针头内径0.9mm，调整纺丝电压在10-15KV，距离在8-15cm，速度为0.1-O.5m/h，获得丝素蛋白纳米纤维膜；

步骤六：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)接种于丝素蛋白纳米纤维膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤一还包括：将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm²。

3.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，其特征在于：步骤一中所述的PBS中含有质量浓度0.1％的青-链霉素。

4.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤五还包括：将丝素蛋白纳米纤维膜冷冻干燥，并置于24孔板中，于放射CO⁶⁰辐射消毒。

5.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，其特征在于：所述的丝素蛋白溶液中添加有质量浓度20％的丝素蛋白纳米纤维溶液。

6.根据权利要求5所述的一种胎盘干细胞复合蚕丝蛋白敷料的制备方法，其特征在于，所述的丝素蛋白纳米纤维溶液采用以下方法制备：取丝素蛋白溶液置于60℃恒温箱内浓缩至原体积的一半，再转入通风橱内浓缩至质量分数为20-30％的浓缩液，将浓缩液放入4℃冰箱储存2d后将浓缩液加水稀释到质量分数为0.5％，充分均匀搅拌后放入恒温箱内孵育至形成半透明凝胶状的丝素蛋白纳米纤维溶液。