[发明专利]克隆目标DNA片段的方法及载体

说明书

本发明提供了克隆目标DNA片段的方法及载体，所述方法包括：识别位于目标DNA片段的一侧的CRISPR‑Cas9识别位点以及分别位于所述目标DNA片段两侧的整合位点和第一重组位点，所述第一重组位点位于所述目标DNA片段与所述CRISPR‑Cas9识别位点的之间；将整合位点、识别位点以及第一重组位点克隆到载体中，将spacer序列整合到所述载体上sgRNA序列的5’端；通过同源重组将将所述载体整合到所述目标DNA片段所在的遗传物质上；诱导所述阳性克隆的Cas9编码序列的表达，切割产生的片段两端的两个第一重组位点之间发生同源重组；筛选携带所述目标DNA片段的质粒。本发明的方法步骤简单，成本低，效率高，特别适用从生物体中克隆大的目标DNA片段。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种克隆目标DNA片段的方法及载体。

背景技术

基于CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly InterspacedSmall Palindromic Repeats)/Cas9系统的基因组编辑方法已经深刻的改变了生命科学领域的研究方法和研究内容。CRISPR/Cas9系统是原核生物中广泛存在的适应性免疫系统之一，用于应对外源核酸分子入侵，例如降解噬菌体来源的核酸分子，降解转化入细胞中的外源质粒等。当细胞被首次入侵之后，部分外源DNA序列被捕获，以间隔子(spacer)形式有规律的整合，成为CRISPR序列。为了精确区分自身和外源的DNA分子，外源的DNA分子中spacer序列下游(5’-3’方向)存在PAM(Protospacer Adjacent Motif)基序5’-NGG-3’。当细胞遭遇二次攻击时，这段序列会转录为非编码RNA——crRNA(CRISPR RNA)。在CRISPR II型系统中，还存在一个非编码RNA——tracrRNA与crRNA结合，其被加工，然后指导唯一的蛋白酶Cas9寻找spacer序列和PAM序列，切割二次攻击的DNA双链分子。为了便于载体构建，crRNA:tracrRNA双元分子可以融合为单个的RNA分子——sgRNA(single guide RNA)，其5’端的20nt是spacer，负责识别特定基因的区域。这样只要同时表达Cas9蛋白和sgRNA就有可能实现基因组编辑。与其他类型的CRISPR系统相比，II型系统结构更紧凑。对于CRISPR/Cas9系统，只需要设计不同的RNA序列即可实现针对特异位点的识别和切割。

目前定向克隆大片段DNA的方法中，已经有报道在体外尝试使用CRISPR/Cas9系统，类似于限制性内切酶的作用，将目标片段从基因组DNA中分离出来。这种方法的缺点在于过分依赖体外制备的高质量、文库构建级别的基因组DNA。由于制备高质量基因组DNA的技术需要丰富经验，常规实验室往往无法便捷的使用。因此，直接从生物体内克隆大片段DNA到载体上就成为一种很有优势的选择。然而，目前已经报道的直接从体内克隆大片段DNA的方法都是基于位点特异性重组系统，需要将重组酶识别位点预先整合到目标DNA片段的两侧，然后诱导重组酶表达使目标DNA片段环出。这种方法的缺点是需要经过反复的遗传操作，时间成本较大。

发明内容

现有技术中克隆大片段DNA时，过分依赖体外制备的高质量、文库构建级别的基因组DNA，所以成本较高、技术复杂、效率较低。此外，体内克隆的方法需要多步遗传操作导入位点特异性重组酶的识别位点，费时费力。