[发明专利]海鱼弧菌检测用引物对、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.海鱼弧菌检测用引物对，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO.1/2。

2.海鱼弧菌检测用试剂盒，包括碱基序列为SEQ ID NO.1/2的引物对。

3.根据权利要求2所述的海鱼弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括浓度为10～100nmol/L的海鱼弧菌标准菌株的DNA提取物。

4.一种海鱼弧菌的检测方法，其特征在于，所述方法包括以SEQ ID NO.1/2为引物对进行TD-PCR扩增的步骤。

5.权利要求4所述的海鱼弧菌的检测方法，其特征在于，所述TD-PCR扩增以海鱼弧菌gyrB基因941～1370位的核酸序列为靶基因。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的TD-PCR扩增反应条件为

①94℃预变性4min；

②扩增：94℃30s、69℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30s、68℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、67℃30S、72℃1min，2个循环；扩增:94℃30S、66℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、65℃30S、72℃1min，2个循环；扩增:94℃30S、64℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、63℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、60℃30S、72℃1min，18个循环；

③72℃延伸7min，4℃保存。

7.权利要求4所述的海鱼弧菌检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA，得到模板液；

(2)TD-PCR扩增：

反应体系：模板液2μL、10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP 2μL、Taq酶0.125μL、浓度为10μM的引物对SEQ ID NO.1/2 1μL、补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s；

反应条件：①94℃预变性4min；②扩增：94℃30s、69℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30s、68℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、67℃30S、72℃1min，2个循环；扩增:94℃30S、66℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、65℃30S、72℃1min，2个循环；扩增:94℃30S、64℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、63℃30S、72℃1min，2个循环；扩增：94℃30S、60℃30S、72℃1min，18个循环；③72℃延伸7min，4℃保存；

⑶TD-PCR扩增产物电泳检测：

用电泳缓冲液制备2％琼脂糖凝胶；取步骤⑵所制备的TD-PCR扩增产物5μL，与1μL上样缓冲液混合后点样，用DNA分子量标记物做参照；3V/cm～5V/cm恒压电泳，电泳20min～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存；

⑷结果判定：以海鱼弧菌标准菌株作为阳性对照，以其它非海鱼弧菌菌株作为阴性对照，以灭菌双蒸水为模版作为空白对照进行步骤⑴～⑷的操作；

如待测样品扩增片断大小与阳性对照一致即可判定为阳性，若样品无扩增产物或者产物片段大小不一致即可判定为阴性，阳性扩增片段需进行测序并与参考序列进行比对。

8.权利要求7所述的海鱼弧菌检测方法，其特征在于，所述的步骤⑴模板液的制备方法是：待测样品以3％氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养至菌浓度约0.5麦氏浊度时，取1.0mL培养液于13000rpm离心5min，弃上清液，用DNA提取试剂盒处理的模板液，或者取1.0mL培养液于13000rpm离心5min，弃上清液，然后加入100μL灭菌双蒸水振荡混匀后煮沸10min，冷却至室温后13000rpm离心2min，取2μL上清液做模板液。