[发明专利]一种制备含有多个重复单元DNA长探针的方法

说明书

本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体涉及一种制备含有多个重复单元DNA长探针的方法。采用平末端内切酶和切刻内切酶同时切割含有多个重复单元DNA双链的质粒，而后利用lambda外切酶的作用原理进行特异性切割，切割后通过电泳分离即得到含有多个重复单元的目的单链DNA。本发明方法适用于制备所有序列成分的DNA探针，尤其是针对难以进行PCR扩增的序列，如含有多个重复单元的，且所制备的探针长度可达800nt，解决了多重复单元DNA长探针制备的技术问题。

技术领域

本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体涉及一种制备含有多个重复单元DNA长探针的方法。

背景技术

Lambda核酸外切酶是一个高度持续性从双链DNA 5′-3′端选择性切割磷酸化单链的核酸外切酶。Lambda核酸外切酶的最适底物是5′磷酸化的平末端双链DNA，它以3′端核酸链为模板，从DNA的5′末端开始按顺序进行切割，在两端中央位置形成单链^【1】。Lambda核酸外切酶的另一特点是不能从nick(切刻)位点及gap位点的5′端开始切割^【2】。

分支DNA信号放大技术(branched-DNA,bDNA)是Chiron公司推出的一种的核酸杂交信号放大技术，该检测方法具有高灵敏度，非扩增等特点^【3】。目前主要应用于HPV,HBV,HCV,HIV等病毒的检测，基因表达分析以及肿瘤基因分析等方面。

分支DNA信号放大技术在杂交检测过程中主要用到以下这几种探针： CP(captμreprobe)-固定在微孔板上，用于捕获目的序列；CE(capt μ re extender)-一端与CP所捕获的目标序列结合，另一端与preamplifier 结合；preamplifier-预放大分子，一端与CE结合，其他部分由5-15个重复单元组成，amplifier-结构与preamplifier相似，但序列不同，一端与preamplifier的重复单元结合，其他位点与标记探针结合。通过多级杂交，实现对目的序列的信号放大。

现阶段分支DNA信号放大技术所涉及多重复单元DNA探针，其本质是含有多个约20nt重复单元的单链DNA。

多重复单元序列在进行PCR的过程中会发生错位配对现象，导致扩增产物长短不一，因此，含有PCR扩增过程的探针制备方法均不适用于多重复单元探针的制备。

而且多重复单元的DNA在PCR过程中容易出现错位退火导致无法扩增出目的产物，因此不能使用带有PCR过程的探针制备方法来制备含有重复单元DNA探针。目前制备多重复单元探针的方法主要是通过核酸合成仪合成，但其合成受长度限制，只能合成约100nt的探针，且得率随探针长度增加而降低。一些商业化的生物技术服务公司，如生工生物工程 (上海)股份有限公司http://www.sangon.com，金斯瑞生物科技有限公司http://www.genscript.com，所提供的单链DNA合成服务长度只能达到约130nt。探针长度不足会影响preamplifier和amplifier中重复单元的数目，严重限制了bDNA结构的放大倍数。为了提高preamplifier 和amplifier中重复单元的数目，有文献通过搭桥连接的方法，将3条长度分别为86nt,79nt和73nt的探针拼接在一起，获得了一条239nt的多重复单元探针^【4】，但是随着拼接片段的数目增加，连接效率会大大降低，依然受到长度的制约。

1.An Exonuclease Induced by BacteriophageλJOHN W.LITTLE,I.R. LEHMAN,AND A.D.KAISER From the Department of Biochemistry, Stanford UniversitySchool of Medicine,Palo Alto,California 94304.