[发明专利]一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株及制备方法、应用在审
| 申请号： | 201710266003.3 | 申请日： | 2017-04-21 |
| 公开（公告）号： | CN107227300A | 公开（公告）日： | 2017-10-03 |
| 发明（设计）人： | 方勇飞;牟方祥;吴红;陈思;闫彩霞;陈欣 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院;武汉金开瑞生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/20 | 分类号： | C12N5/20;C07K16/44;C12R1/91 |
| 代理公司： | 北京众达德权知识产权代理有限公司11570 | 代理人： | 刘杰 |
| 地址： | 400038 重*** | 国省代码： | 重庆;85 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 分泌 蝶呤 杂交瘤 细胞株 制备 方法 应用 | ||
1.一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株生物保藏编号为CCTCC NO:C201726。
2.如权利要求1所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
用抗原MTX-BSA免疫Balb/c小鼠；
收集免疫小鼠的脾细胞，并与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，融合的杂交瘤细胞用HAT培养基进行选择性培养；
采用间接竞争ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清中的抗体含量进行检测，筛选获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3.根据权利要求2所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述免疫包括：所述小鼠为6-8周龄雌性Balb/c小鼠，将纯化的MTX-BSA蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化，然后采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫。
4.根据权利要求2所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述融合包括：无菌条件下取小鼠脾脏制成细胞悬液，在PEG1450介导下，融合小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞，融合后加入DMEM培养基终止。
5.根据权利要求2或4所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞的个数比为1:5。
6.根据权利要求2所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述检测包括：液体和半固体融合板检测。
7.根据权利要求6所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述液体融合板检测包括：待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在竞争法ELISA质控合格后挑选阳性孔作亚克隆。
8.根据权利要求6所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述半固体融合板检测包括：常规细胞融合后，用甲基纤维素半固体培养基重悬细胞沉淀，重悬于20ml 2％甲基纤维素浓度的半固体培养基，于细胞培养皿中培养；7-10天后观察培养皿中细胞克隆的大小以及数量，在体式显微镜下挑出至20％胎牛血清的HT培养基中培养2-3天后进行效价检测，在竞争法ELISA质控合格作亚克隆。
9.如权利要求1所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的应用，其特征在于：所述杂交瘤细胞株用于制备抗甲氨蝶呤单克隆抗体，所述单克隆抗体可用于特异性识别甲氨蝶呤。
10.根据权利要求9所述的分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的应用，其特征在于：所述抗甲氨蝶呤单克隆抗体的制备方法包括如下步骤:将所述杂交瘤细胞注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集所述小鼠的腹水，所述腹水经过预处理后纯化。
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