[发明专利]一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法

说明书

本发明公开一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，属于医药技术领域。该方法是将去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液和H9C2心肌细胞培养液混合后培养iPSCs。本发明证实H9C2心肌细胞培养液可有效诱导iPSCs心肌定向分化。促进多向分化潜能基因OCT‑4荧光猝灭，细胞免疫荧光实验证实可提高心肌α‑横纹肌辅肌动蛋白(α‑actinin)表达，qPCR结果表明β‑MHC、GATA4、Mef2C、NCX‑1等mRNA表达显著增加。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法。

背景技术

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是引起死亡最常见的疾病之一，且心肌细胞一旦损伤缺乏再生能力，体外诱导培养心肌细胞进行心脏移植已成为治疗心血管疾病重要的研究热点。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有多向分化的潜能,可分化为多种细胞。目前研究虽证实iPSCs体外可分化心肌细胞，但其自然分化效率不高。IPSCs分化为心肌细胞受多种因素调控，特别是细胞外微环境的变化。目前有关H9C2心肌细胞培养液诱导干细胞分化的研究鲜有报道，且不同类型细胞对于相同的刺激因素表现不同的诱导效应。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCsiPSCs定向心肌分化的方法。

目前诱导iPSCs心肌定向分化的方法各异，本研究为了推进iPSCs的临床应用，旨在提供一种有效安全的诱导心肌分化方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法，包括如下步骤：

通过将去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液和H9C2心肌细胞培养液混合后培养iPSCs，倒置显微镜、细胞免疫技术以及qPCR检测其心肌定向分化情况。实验证实不同浓度H9C2分化培养液均可在第7天显著减少小鼠诱导性多能干细胞OCT-4表达，但对各心肌基因表达诱导作用不一，以1：2体积比的H9C2分化培养液最佳。

所述的H9C2心肌细胞培养液，是将H9C2心肌细胞常规培养3d，传代前吸取培养液过滤即可。

优选的，所述的去除了LIF的常规iPSCs细胞培养液和H9C2心肌细胞培养液的体积比为1：1～1:2；更优选为1:2。

优选的，所述的培养iPSCs的时间为10～14d。

本发明的机理是：本申请通过研究H9C2心肌细胞培养液对诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)定向心肌分化的影响，以建立一种安全有效的体外诱导iPSCs分化为心肌细胞的实验方法，iPSCs作为心肌定向分化的理想细胞，具有广阔的应用前景，目前虽然诱导其心肌定向分化的方法很多，但仍未发现一种极为有效的诱导方法，造成其治疗效果受限。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明证实H9C2心肌细胞培养液可有效诱导iPSCs心肌定向分化。促进多向分化潜能基因OCT-4荧光猝灭，细胞免疫荧光实验证实可提高心肌α-横纹肌辅肌动蛋白(α-actinin)表达，qPCR结果表明β-MHC、GATA4、Mef2C、NCX-1等mRNA表达显著增加。

附图说明

图1是诱导性多能干细胞EGFP表达变化情况。

图2是免疫荧光分析检测诱导性多能干细胞拟胚体中心肌特异标志物α肌动蛋白(α-actin)的表达情况。

图3是qPCR检测诱导性多能干细胞拟胚体中心肌特异性标志物的表达情况。