[发明专利]钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法

说明书

本发明公开一种钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法，属于医药技术领域。该方法是通过构建NCX1慢病毒颗粒并转染至iPSCs，辅以丹参酚酸B联合诱导。所述的丹参酚酸B的浓度为1～100μM。本发明证实钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B可有效诱导iPSCs心肌定向分化。丹参酚酸B可有效促进NCX1表达，同时促进心肌标志物α肌动蛋白(α‑actin)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达显著提高。且iPSCs形态可见心肌细胞样梭形改变。iPSCs作为修复急性心肌梗死的种子细胞，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法。

背景技术

急性心肌梗死的干细胞治疗仍存在诸多方面的困难，如种子细胞的选择问题、心肌坏死范围广泛、细胞移植归巢效率低下及局部心肌微环境缺血缺氧等，因此，其临床应用仍然未能得以广泛的开展。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是通过重编程体细胞获得的具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells，ECSs)相似的高度增殖和多向分化潜能的一种多能干细胞，又因其缺少胚胎干细胞的免疫原性及道德伦理限制，诱导性多能干细胞有望成为修复急性心肌梗死后心肌的具有巨大临床应用前景的种子细胞。

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，除了传统的活血化瘀、养心安神的功效外，还有抗氧化，抑制血小板聚集、促进血栓溶解，抗肿瘤，调节免疫功能的作用，其在心血管疾病方面的新药理作用、作用机制和药代动力学的研究日趋深入，使其拥有非常广阔的临床应用前景。丹参酚酸B是其中一种单体成份。

作为心肌分化最早的标志物钠钙交换体钠钙交换体启动子广泛分布于心肌细胞膜上，双向转运胞膜内外Na⁺和Ca²⁺，参与心肌兴奋-收缩耦联及胞内钙稳态的维持，钠钙交换体1是一个糖基化的具有12个跨膜部分的跨膜蛋白，对维持心肌钙平衡有重要作用。

目前利用iPSCs定向心肌分化的方法很多，本研究旨在提供一种新型的诱导方法，进一步推动iPSCs的临床应用。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法。

目前尚无有效诱导iPSCs心肌定向分化的方法，本研究为了推进iPSCs的临床应用，旨在提供一种有效安全的诱导心肌分化方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法，包括如下步骤：

通过构建NCX1慢病毒颗粒并转染至iPSCs，辅以丹参酚酸B联合诱导，倒置显微镜、细胞免疫技术以及Western Blots观察其转染情况、形态学以及心肌标志物表达情况。实验证实钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B可有效诱导iPSCs定向心肌分化。

优选的，所述的丹参酚酸B的浓度为1～100μM；更优选为10～100μM。

优选的，所述的培养的条件为5％CO₂、37℃培养15～20d。

本发明的机理是：拟通过钠钙交换体1启动子(sodium-calcium exchangerpromoter，NCX1)联合丹参酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)诱导诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)定向心肌细胞分化，iPSCs作为修复急性心肌梗死的种子细胞，具有广阔的应用前景。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：