[发明专利]一种基于81°‑TFG的NDV免疫传感器的制作方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体设计到兽医学、免疫学及生物医学工程。

背景技术

新城疫（Newcastle Disease，ND）是一种急性、败血性、高度接触性传染病，其传播迅速，发病率和死亡率高，国际兽医局（OIE）将其列为必须报告的疫病,我国将其列为一类传染病。近年来新城疫病毒检出率在 0.5%~2%之间，如防控工作稍有松懈，不排除局部点状散发甚至引起大规模流行的可能。因此，各地畜牧兽医部门和规模化养禽企业都把禽新城疫作为重大动物疫病加以防控。

目前，对新城疫的主要检测技术有鸡胚分离方法、血凝-血凝抑制(HA-HI)试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）等。鸡胚分离方法法是一种敏感特异的方法，但整个过程约需3周左右，且操作烦琐，不利于现场检疫或监测；HA-HI试验比较敏感，但受外界因素影响较大而削弱了其实用价值；ELISA方法适合于大批量血清学调查，但因其耗时长，特异性不强，程序相对复杂，现场操作不便；PCR方法虽然可直接检出病毒的基因，但所需的设备昂贵，在临床检测方面受到了很大的限制。CN1827775A（专利申请号为200510008997.6）“检测新城病毒的核苷序列、试剂盒及检验方法”，该发明选择新城疫病毒F 基因（合成F 蛋白）作为靶区域，选择能够反映裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针，建立荧光PCR 检测新城疫病毒，该方法比传统的PCR 方法灵敏度高100-1000 倍，但从样品处理到出结果需要4小时左右，该方法的实施还需荧光定量PCR仪等昂贵仪器，不宜在基层推广。因此，研发一种快速检测新城疫病毒的诊断方法，以便对疫情进行现场及时诊断是目前养禽生产中急需解决的问题。

过去的十多年，由于光纤光栅传感器不仅具有光纤传感器家族固有的微型尺寸、远程传感、灵敏度高等共同的特点，还具有波长调制（不受光强度噪声影响）、绝对测量等诸多优点，已经备受关注和研究，并应用于众多的交叉领域，比如：智能结构工程监测、环境环保的监测等。其中，对于长周期光纤光栅（Long Period fiber grating, LPFG）和小角度倾斜光纤光栅，由于它们固有的对外部介质折射率（Refractive index，RI）敏感的特性，国内外众多学者对它们的表面进行生化功能修饰之后，应用于生物医学、生物化学及生命科学等领域的各种生物化学参考的实时、快速检测研究，然而，普通的LPFG对RI的敏感度并不高（~20nm/RIU），因此需要腐蚀其包层以提高其RI灵敏度，但这样会降低传感器的机械强度和鲁棒性，而且，LPFG对环境温度和应变十分的敏感，因此将它实际应用于生化方面的传感时，会存在严重的交叉敏感问题，从而降低传感器的稳定性和重复性。而对于基于小角度倾斜光纤光栅的生化传感器，所存在的主要问题是，由于存在众多密集的反向包层模式，不便于波长信号的鉴别和提取。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明解决耗时长，特异性不强，程序相对复杂，现场操作不便等问题，提供一种基于81°-TFG的NDV免疫传感器的制作方法，以及用于对疫情进行现场及时诊断的检测方法。

本发明通过以下技术方案来实现：一种基于81°-TFG的NDV免疫传感器的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）NDVF蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将已构建的含有NDVF蛋白基因的重组表达载体阳性菌进行诱导表达（是现有技术），表达产物经镍柱亲和层析纯化，以此蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合，建立间接ELISA，用于筛选阳性克隆，采用体内诱生法制备单抗腹水，并使用Protein A柱纯化腹水中的抗体；

2）81°-TFG的表面修饰

在免疫传感器表面修饰中使用SPA蛋白，均匀分布在金黄色葡萄球菌细胞壁表面上，通过羧基端（‘-COOH’）与细胞壁肽聚糖呈共价连接；SPA多肽链由A、B、C、D四个同源区组成，每个同源区都能与人及多种哺乳动物血清中IgG的‘Fc位点结合’，而且不会封闭抗体上能与抗原结合的‘Fab活性位点’，并能使Fab的活性位点片段裸露在修饰膜的外层而伸向流动相；