[发明专利]自体来源的间充质干细胞向鼻粘膜样上皮细胞分化方法及试剂盒

权利要求书

1.一种自体来源的间充质干细胞向鼻粘膜样上皮细胞分化方法，其特征在于，所述方法包括：将自体来源的间充质干细胞加入细胞诱导液中诱导分化得到鼻粘膜样上皮细胞，所述细胞诱导液主要是将DMEM干粉培养基、胎牛血清、EGF、FGF、氢化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、链霉素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM干粉培养基40-60g、所述胎牛血清4-6g、所述EGF 6-10μg、所述FGF 10-20μg、所述氢化可的松溶液5-10mL、所述谷氨酰胺0.15-0.3g、所述青霉素1-2×10⁵U、所述链霉素0.1-0.2g；所述氢化可的松溶液是将氢化可的松用无水乙醇溶解而成，每L所述无水乙醇溶解所述氢化可的松5-10mg；

所述细胞诱导液还含有阿拉伯半乳聚糖、烟酰胺和胰岛素，每L所述注射用水溶解所述阿拉伯半乳聚糖1-3g、所述烟酰胺0.2-0.5g、所述胰岛素0.05-0.1g。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞诱导液还含有羧甲基纤维素钠、山梨酸钾和甘氨酸，每L所述注射用水溶解所述羧甲基纤维素钠0.5-1.5g、所述山梨酸钾0.05-0.08g、所述甘氨酸0.02-0.06g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导分化的培养条件为：在温度为37℃、CO₂体积分数为5％、饱和湿度的条件下诱导培养12-16天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对自体来源的间充质干细胞进行诱导分化之前还包括分离获取间充质干细胞和培养扩增间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分离获取间充质干细胞包括：无菌收集含有间充质干细胞的自体组织，用PBS缓冲液冲洗1-3min，再用眼科剪剪成1-2mm³大小的组织碎块，将组织碎块加入组织分解液中，水浴震荡，37℃、220r/min振荡30-45min，观察到脂肪逐渐变为乳糜状后置入离心机，2000r/min离心5min，弃上层清液，即可获得自体来源的间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养扩增间充质干细胞包括：加入适量PBS缓冲液重悬分离后的自体来源的间充质干细胞，吹打后接种于细胞培养液中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下进行培养，4h后更换细胞培养液，弃去未贴壁的细胞，每隔3-4d更换细胞培养液，待细胞生长达到80％融合时加入细胞消化液将贴壁细胞消化分离3-5min，按1：3比例进行传代接种，每3天更换细胞培养液1次，当贴壁细胞达到融合时再次传代，将传至第三代的间充质干细胞收集，融于0.9％的氯化钠溶液中去，呈悬浊液，保存于4℃环境中；所述细胞培养液主要是将H-DMEM干粉培养基、胎牛血清、D-木糖、青霉素、链霉素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述H-DMEM干粉培养基30-50g、所述胎牛血清1-5g、所述D-木糖0.5-1g、所述青霉素1-2×10⁵U、所述链霉素0.1-0.3g。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液还含有甲壳糖、微晶纤维素和琥珀酸钠，每L所述注射用水溶解所述甲壳糖2-5g、所述微晶纤维素1-2g、所述琥珀酸钠0.3-0.8g。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液还含有酒石酸钾钠和甲酸钙，每L所述注射用水溶解所述酒石酸钾钠1-2g、所述甲酸钙0.2-0.8g。

9.一种用于自体来源的间充质干细胞向鼻粘膜样上皮细胞分化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体和位于盒体内部的若干试剂瓶，若干所述试剂瓶内分别盛装有组织分解液、细胞培养液、细胞消化液和细胞诱导液，所述细胞诱导液主要是将DMEM干粉培养基、胎牛血清、EGF、FGF、氢化可的松溶液、谷氨酰胺、青霉素、链霉素用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM干粉培养基40-60g、所述胎牛血清4-6g、所述EGF 6-10μg、所述FGF 10-20μg、所述氢化可的松溶液5-10mL、所述谷氨酰胺0.15-0.3g、所述青霉素1-2×10⁵U、所属链霉素0.1-0.2g；所述氢化可的松溶液是将氢化可的松用无水乙醇溶解而成，每L所述无水乙醇溶解所述氢化可的松5-10mg。