[发明专利]肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法与应用在审
申请号: | 201710279994.9 | 申请日: | 2017-04-26 |
公开(公告)号: | CN107144692A | 公开(公告)日: | 2017-09-08 |
发明(设计)人: | 张华莉;杨洋;黄莉;王莉;罗卉;左晓霞;朱红林;刘瑛;王国春;李懿莎;曹航;刘可;刘梅冬;陈广文;肖献忠 | 申请(专利权)人: | 中南大学 |
主分类号: | G01N33/558 | 分类号: | G01N33/558;G01N33/535 |
代理公司: | 长沙星耀专利事务所(普通合伙)43205 | 代理人: | 宁星耀 |
地址: | 410083*** | 国省代码: | 湖南;43 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 特异性 自身抗体 nxp2 抗体 免疫 印迹 检测 方法 应用 | ||
1.肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)利用引物对NXP2-F/NXP2-R2和引物对NXP2-F2/NXP2-R从pCMV-myc-NXP2全长质粒中分别PCR扩增人NXP2的N端或C端;
(2)用胶回收试剂盒(Omega,D2500-01)回收纯化步骤(1)所述的NXP2的N端或C端,然后克隆至pCMV-myc载体,构建含NXP2N端或NXP2C端且带有Myc标签的pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C质粒;
(3)酶切鉴定确定步骤(2)所述pCMV-myc-NXP2N、pCMV-myc-NXP2C质粒的插入子,并测序验证其NXP2N端、NXP2C端序列和读码框的准确性;
(4)将步骤(3)所述验证后的pCMV-myc-NXP2N或pCMV-myc-NXP2C质粒瞬时转染人胚肾HEK293细胞48小时,通过Western Blot法分别用c-myc抗体、NXP2抗体检测其在HEK293细胞中的过表达;
(5)将步骤(4)中所述过表达NXP2N端或NXP2C端的HEK293细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳,分别用NXP2抗体阳性的肌炎患者血清和正常人的血清作为一抗、兔抗人IgG H&L作为二抗进行检测,证实NXP2抗体阳性血清能够特异性识别步骤(4)中所述HEK293细胞过表达的带有myc标签的NXP2N端和NXP2C端;
(6)将步骤(4)中所述过表达NXP2C端的HEK293细胞裂解液进行SDS-PAGE凝胶电泳,用待测肌炎患者血清作为一抗、兔抗人IgG H&L作为二抗进行检测。
2.根据权利要求1所述的肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述的引物对NXP2-F/NXP2-R2包括引物NXP2-F和引物NXP2-R2,所述引物NXP2-F的序列如SEQ ID NO:1所示,所述引物NXP2-R2的序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述引物对NXP2-F2/NXP2-R包括引物NXP2-F2和引物NXP2-R,所述引物NXP2-F2的序列如SEQ ID NO:3所示,所述引物NXP2-R的序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述的PCR扩增人NXP2的N端为NM_015358.2的80-1576bp,即Q14149的1-500aa;所述的PCR扩增人NXP2的C端为NM_015358.2的1274-2896bp,即Q14149的400-939aa。
5.根据权利要求1所述的肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法,其特征在于,采用NXP2抗体阳性的肌炎患者血清作为一抗、兔抗人IgG H&L作为二抗。
6.根据权利要求1-5任一项所述的肌炎特异性自身抗体NXP2抗体的免疫印迹检测方法的应用,其特征在于,用于检测肌炎患者的抗NXP2自身抗体。
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