[发明专利]一种细胞色素C溶液澄清方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，尤其是涉及一种细胞色素C溶液澄清方法。

背景技术

细胞色素C广泛分布于动物、植物和酵母等微生物中，定位在线粒体内膜的外表面。因分子中有多个碱性氨基酸(特别是Lys)残基，在生理pH环境带正电荷，可通过静电相互作用与膜磷脂质相缔合，能被H⁺和金属离子从膜上置换取代下来。

现有细胞色素C提取方法为硫酸溶液提取、沸石捕集、硫酸铵分级、三氯乙酸沉淀以及离子交换色谱纯化等五大步骤。硫酸溶液提取后，经过过滤除渣料液仍然难以做到澄清，因此影响沸石捕集细胞色素C的效率。

如果能在沸石捕集细胞色素C之前将料液处理澄清，可以用精滤的方法，但是这种方法对于大量的料液处理速度有限，因此如果能够加入絮凝剂使料液快速絮凝澄清，那么经过简单的过滤即可快速得到澄清的料液。

发明内容

本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种有效的细胞色素C溶液澄清方法。现有细胞色素C生产工艺中料液的澄清方法是粗滤和精滤。商品用细胞色素C使用动物心肌提取，提取的溶液一般含有很多不溶物，直接过滤速度较慢。如果加入絮凝剂使其中的不溶成分快速絮凝沉降，那么将提高过滤速度和过滤质量。选择壳聚糖作为絮凝剂，是由于其来自于天然产物，操作步骤简单、没有毒副作用、达到絮凝效果后能够完全除去、不影响最终产品质量，所形成的絮凝沉淀能够保持很长一段时间，即使轻微搅动也不会被打散。

本发明的目的是这样实现的，动物心肌提取出的细胞色素C溶液，加入壳聚糖作为絮凝剂，搅拌至不溶物絮凝成团后，静置适当时间后过滤澄清即可。

壳聚糖的加入量是澄清的重要的影响因素。壳聚糖的加入重量为细胞色素C溶液重量的0.01～0.03％。针对于细胞色素C溶液而言，少于0.01％的加入量通常不足以将所有不溶物沉淀下来，多于0.03％的加入量，有可能会造成壳聚糖的浪费，并且有可能影响细胞色素C收率。

脱乙酰度70～90％的壳聚糖比较常见，粘度比较稳定，容易在不同工艺中均达到稳定的絮凝效果。但是在本发明中使用脱乙酰度较高的壳聚糖，这是因为实验发现不同脱乙酰度的壳聚糖中，脱乙酰度较高的壳聚糖能够以最快的速度在细胞色素C溶液中絮凝，可使工艺快速进行，处理成吨的料液时分外有利。壳聚糖脱乙酰度范围91～95％。壳聚糖在使用前需预先溶解。由于壳聚糖溶解于酸性环境，因此使用盐酸或醋酸来调节壳聚糖溶液pH，使其稳定在3.0～3.5。这个pH范围下，壳聚糖可以充分溶解，并且不会很快分解导致粘度降低，从而影响絮凝效果。壳聚糖配制成水溶液浓度应限定在3％，过低的浓度在生产中不易操作，过高的浓度会增加壳聚糖的溶解时间。壳聚糖配制成水溶液后应尽快使用，存放时间不宜超过12小时。较高的离子强度不利于壳聚糖的絮凝，处理的料液应避免高盐环境。壳聚糖会溶于酸性溶液，因此为了生产絮凝，细胞色素C溶液应保持偏中性或碱性环境。将细胞色素C溶液调节pH 7.0～8.0为宜。

具体实施方式：

实施例1，一种细胞色素C溶液澄清方法，将5kg猪心绞碎，加入适量浓度为2％硫酸溶液，pH值控制在3.5，室温提取2小时，粗滤去渣，得到提取液50升，用氨水调节pH 7.0，此时料液浊度大于200NTU。

现场配制壳聚糖溶液，取5克脱乙酰度91％的壳聚糖，置于0.17升纯化水中，用盐酸维持pH3.0，搅拌使壳聚糖溶解。将壳聚糖溶液缓缓加入细胞色素C水解液中并保持搅拌，约10分钟后出现可见絮凝后停止搅拌并静置，在不同静置时间取上清液，使用中速定性滤纸在重力作用下过滤后检测浊度如下表。

实施例2，一种细胞色素C溶液澄清方法，细胞色素C溶液提取方法同实施例1，用氨水调节pH 7.5，此时料液浊度大于200NTU。

现场配制壳聚糖溶液，取10克脱乙酰度93％的壳聚糖，置于0.33升纯化水中，用醋酸维持pH3.2，搅拌使壳聚糖溶解。将壳聚糖溶液缓缓加入细胞色素C水解液中保持搅拌，约10分钟后出现可见絮凝后停止搅拌并静置，在不同静置时间取上清液，使用中速定性滤纸在重力作用下过滤后检测浊度如下表。

实施例3，一种细胞色素C溶液澄清方法，细胞色素C溶液提取方法同实施例1，用氨水调节pH 8.0，此时料液浊度大于200NTU。