[发明专利]一种重组醛酮还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种重组醛酮还原酶突变体，其特征在于所述突变体是分别将SEQ ID No. 1所示氨基酸序列第297位的色氨酸突变为组氨酸获得的、或第296位的酪氨酸突变为色氨酸且第297位的色氨酸突变为组氨酸获得的。

2.一种编码权利要求1所述重组醛酮还原酶突变体的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组表达载体。

4.一种由权利要求3所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述醛酮还原酶突变体在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含有重组醛酮还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为辅酶再生酶，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯底物，以葡萄糖为共底物，以pH值5.0~9.0的100mM磷酸钠缓冲液为反应介质构成反应体系，超声破碎，在25~55^°C转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物初始浓度为10~100 g/L，共底物终浓度15~150 g/L，催化剂湿菌体用量10~100 g/L，辅酶再生酶用量10~100 g/L。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：

（1）斜面培养：将含有重组编码醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，在28~37^°C培养12~24 h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20 g/L琼脂，溶剂为水，pH值为7.0；

（2）种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37^°C培养10~12h，获得种子液；LB液体培养基终浓度组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7.0；

（3）发酵培养：以体积浓度2%的接种量将种子液接种至含有终浓度50 μg/mL Kan的LB液体培养基进行发酵培养，37^°C，180 rpm培养至培养液的OD₆₀₀为0.6~0.8之间，加入IPTG至终浓度0.1mM，28^°C，180 rpm诱导培养12 h，4^°C、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。