[发明专利]一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法。本发明采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用谷氨酰胺、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、生物素和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明采用LMH传代细胞系进行禽流感H9亚型病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。而且本发明制备得到的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的禽流感病毒H9亚型灭活疫苗。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法。

背景技术

H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，但发病率高，其主要临床表现为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。而且，该H9N2亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物，包括人，即有机会在人类中大规模流行，给人类健康带来严重的威胁。

虽然H9亚型禽流感灭活疫苗已广泛应用，该病也得到了有效控制，但是近几年来H9亚型禽流感在免疫鸡群中时有发生。为此，通过高适应载体表达高质量的有效抗原同时减少原有的生产成本达到针对同源/非同源H9亚型AIV提供免疫保护的疫苗尤为必要。

目前，我国的禽流感H9亚型主要是通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒而获得，专利文献CN102093982B公开了一种禽流感H9N2亚型病毒毒株及其应用，所述禽流感H9N2亚型病毒毒株(Orthomyxoviridae)的CGMCC NO：3526。该禽流感H9N2亚型病毒毒株具有良好的特异性和免疫原性，鸡胚尿囊液凝集红细胞的作用不能被抗NDV阳性血清、抗EDS76阳性血清、抗M 41阳性血清、抗H5亚型禽流感病毒单因子阳性血清以及抗H 7亚型禽流感病毒单因子阳性血清所抑制，而能被H9亚型禽流感病毒单因子阳性血清抑制。免疫雏鸡能产生对H9特异的HI抗体。该禽流感H9N2亚型病毒毒株可以预防禽类的H9亚型禽流感，用于病毒的鉴定和流行病学的调查。但是上述禽流感H9N2亚型病毒毒株采用SPF鸡胚载体进行病毒增殖，病毒滴度不高且用SPF鸡胚载体大规模生产其生产成本非常昂贵，不利于大规模生产。

同时，通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒会出现如大流行时疫苗的供给量往往受到SPF鸡胚数量的限制；有些毒株无法在鸡胚中复制，因此难以获得足够量的病毒，只有鸡胚适应株才能获得高产量病毒；受体结合特异位点的变异导致抗原性降低；疫苗生产下游技术一成不变且十分繁重、易于污染等等，大大的限制了禽流感H9亚型疫苗的推广和应用。

发明内容

为了解决现有技术中的缺陷，本发明提供一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法。本发明是采用动物传代细胞LMH细胞进行病毒增殖，在培养流感病毒时能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能维持病毒抗原稳定，同时在培养过程中不需要添加胰蛋白酶，培养得到的流感病毒具有病毒含量高，血凝价高，免疫原性好的优点。

本发明提供了一种禽流感病毒H9亚型灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000-2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO₂的条件下2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；

S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型病毒液按终体积1:50～1:200接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30-60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO₂的条件下培48～72h，出现70～80％细胞病变，得病变细胞；