[发明专利]一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型二联灭活疫苗的制备方法。本发明采用LMH传代细胞系作为载体细胞进行病毒增殖，采用谷氨酰胺、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、生物素和生长因子组成的培养基A进行培养，收集病毒液，灭活，制备成疫苗。本发明采用LMH传代细胞系进行禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒增殖不需要额外添加胰酶，而且LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖，可以有效的简化工艺，降低成本。而且本发明制备得到的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的病毒含量高、稳定性好，安全性高，是一种较为理想的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型二联灭活疫苗的制备方法。

背景技术

H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，但发病率高，其主要临床表现为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。而且，该H9N2亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物，包括人，即有机会在人类中大规模流行，给人类健康带来严重的威胁。

禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，临床上常常出现包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20-40天龄鸡只出现30％以上的死亡率。此外，其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。而且该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。因此，目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。

虽然H9亚型禽流感和禽I群腺病毒灭活疫苗已广泛应用，该病也得到了有效控制，但是近几年来H9亚型禽流感和禽腺病毒4型感染在免疫鸡群中时有发生。为此，通过高适应载体表达高质量的有效抗原同时减少原有的生产成本达到针对同源/非同源H9亚型AIV、禽腺病毒4型流行株提供免疫保护的疫苗尤为必要。

目前，我国的禽流感H9亚型和禽I群腺病毒主要是通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒而获得，专利文献CN105582533A公开了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗，该疫苗的制备的将将禽流感病毒、禽腺病毒经卵黄囊途径接种于SPF鸡胚进行病毒增殖，制备得到的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。但是采用SPF鸡胚载体进行病毒增殖，病毒滴度不高且用SPF鸡胚载体大规模生产其生产成本非常昂贵，不利于大规模生产。

同时，通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒会出现如大流行时疫苗的供给量往往受到SPF鸡胚数量的限制；有些毒株无法在鸡胚中复制，因此难以获得足够量的病毒，只有鸡胚适应株才能获得高产量病毒；受体结合特异位点的变异导致抗原性降低；疫苗生产下游技术一成不变且十分繁重、易于污染等等，大大的限制了禽流感H9亚型和禽I群腺病毒疫苗的推广和应用。

发明内容

为了解决现有技术中的缺陷，本发明提供一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法。本发明是采用动物传代细胞LMH细胞进行病毒增殖，在培养流感病毒时能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能维持病毒抗原稳定，同时在培养过程中不需要添加胰蛋白酶，培养得到的流感病毒具有病毒含量高，血凝价高，免疫原性好的优点。

本发明提供了一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：