[发明专利]肌肉干细胞体外培养方法及其应用

说明书

本发明涉及肌肉干细胞体外培养方法及其应用。本发明的肌肉干细胞体外培养方法，为采用血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本发明还进一步公开了所述肌肉干细胞体外培养方法所用培养基及其应用。采用本发明的方法，肌肉干细胞可以增殖十次以上。更重要的是，在本发明的培养基中，肌肉干细胞可以连续传代，并继续保持干性和分化潜能，并且扩增后的肌肉干细胞均保持干性和完整分化潜能，能够在体内修复肌肉损伤，这就使得利用体外培养的肌肉干细胞用于再生医学治疗的策略在临床上具有可行性。

本案为以下专利申请的分案申请：

申请号：201310205059X；

申请日：2013年5月29日；

发明名称：肌肉干细胞体外培养方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术与医学领域，特别涉及肌肉干细胞相关的细胞培养与细胞治疗领域。

背景技术

肌肉干细胞负责出生后肌肉组织的生长和再生，且肌肉干细胞在体内没有致癌效果，不存在应用胚胎干细胞时会碰到的伦理问题，因而在肌肉萎缩和重症肌无力等各种肌肉退行性疾病的治疗方面有广阔的应用前景。肌肉干细胞临床应用的一个重要障碍是无法在体外长期培养肌肉干细胞。和大多数成体干细胞一样，肌肉干细胞从体内分离之后，在体外培养系统中只能再分裂2－4次，几乎无法传代。

现有培养肌肉干细胞(卫星细胞)的方法几乎都来源于Bischoff博士在1986年建立的方法，后经过Beauchamp等人的改进，形成现有的在F10基础培养基中添加10ng/ml FGF进行培养的方法。在此培养条件下，肌肉干细胞可以增殖3－5次。在传代时，肌肉干细胞会经过一个严重的危机时期，在这一危机时期，绝大多数细胞都会死去，残留的细胞则分化为不具有干性的前体细胞。所以体外培养1－3代(3－12天)后，分离得到的肌肉干细胞即全部分化为不具有干性的前体细胞，肌肉干细胞的分子标记在这些前体细胞中都无法检测到。注射入小鼠体内后，这些前体细胞参与肌肉损伤修复的能力非常弱，不能在体内形成有功能的干细胞，完全不能进行移植后二次损伤的修复。(Bischoff R.A satellite cellmitogen from crushed adult muscle.Dev Biol.,1986.115(1):140-147.Beauchamp,J.R.,et al.,Expression of CD34and Myf5defines the majority of quiescent adultskeletal muscle satellite cells.J Cell Biol,2000.151(6):p.1221-34.)也就是说，采用现有的肌肉干细胞体外培养系统，培养后的肌肉干细胞传代后要经过一个危机期，危机期后得到的可以增殖的细胞绝大多数已经分化为肌肉祖细胞，丧失了肌肉损伤修复的能力。由于这一问题的存在，使得通过在肌肉干细胞中进行基因修复治疗遗传性的肌肉退行性疾病的方法难以在临床治疗中使用。

发明内容

本发明的目的就是克服现有技术的缺陷，提供一种肌肉干细胞培养基及其应用。

本发明第一方面提供了一种肌肉干细胞体外培养方法，为采用添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞的条件培养基体外培养肌肉干细胞。本发明的肌肉干细胞体外培养方法适合体外长期培养肌肉干细胞。

本发明第二方面提供了一种肌肉干细胞培养基，为添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基或血液细胞条件培养基。

所述添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子，用于制备所述血液细胞条件培养基的血液细胞，均与待培养的肌肉干细胞来源于相同的动物物种。

当添加动物血清培养细胞时，本发明所述的添加有血液细胞的细胞因子的细胞培养基中所添加的血液细胞的细胞因子并不包括所用动物血清中本就含有的细胞因子。