[发明专利]一种用于生产哌啶甲酸的重组质粒、基因工程菌株及方法

说明书

本发明公开了一种用于生产L‑哌啶甲酸的重组质粒和L‑哌啶甲酸异源合成代谢途径加强的高产基因工程菌，及哌啶甲酸的生产方法。本发明还公开了上述重组质粒以及基因工程菌的制备方法。高产基因工程菌构建的策略是：采用pTrc99a单质粒多基因串联表达，将L‑赖氨酸‑α‑氧化酶基因(LysoX),葡萄糖脱氢酶基因(gcd)，Pip2C还原酶基因(DpkA)，赖氨酸转运蛋白酶基因(lysQ)串联，优化各个基因前面的控制转录和翻译的调控元件，将构建的质粒pLMAIP‑05导入到敲除赖氨酸降解途径中的必须基因(cadA)的BL21(DE3)的感受态细胞中，得到一种L‑哌啶甲酸异源合成代谢途径加强的高产基因工程菌(MLPR08)。通过表达赖氨酸转运蛋白酶，提高了底物L‑赖氨酸转运至胞内的速率，缩短发酵时间，进一步促进了L‑哌啶甲酸的合成。

技术领域

本发明属于生物工程领域。本发明涉及一种用L-哌啶甲酸异源合成代谢途径加强的重组质粒和基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产L-哌啶甲酸的生物产品中用途。

背景技术

能源和环保是当今世界面临的重要问题。利用微生物发酵的方式生产L-哌啶甲酸，可以减少对环境的污染，是符合国家和民族走可持续发展之路的新型制造方式。

L-哌啶甲酸(L-Pipecolic acid，简称L-PA)，是一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，它既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，广泛用于许多手性药物和生物活性物质的制备。如，新一代局麻药罗哌卡因(Ropivacaine)、抗精神病药物硫利哒嗪(Thioridazine)、免疫抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)以及抗肿瘤抗生素(Sandramycin)等均是以L-哌啶甲酸或其衍生物为主要原料制得的。这些药物的生物活性取决于哌啶部分的立体化学结构，故合成高纯度的L-哌啶甲酸就显得尤为重要。

由于L-哌啶甲酸及其衍生物具有的生物活性和广泛的应用前景，其合成已引起众多国外研究者的兴趣，并开发出许多合成的新方法和新技术。目前，国际上关于L-哌啶甲酸及其衍生物合成的研究报道较少，L-哌啶甲酸的合成方法主要为化学合成法。化学合成法生产L-哌啶甲酸的主流方法是以3-羟基哌啶盐酸盐为原料在手性双膦配体催化剂(S)-BINAP-RuCl₂作用下合成(S)-N-Boc-哌啶酸。原料先经过三步简单反应得到N-Boc-哌啶甲醚，通入CO₂后，反应物在催化剂S-BuLi/TMEDA催化下转化为不饱和哌啶衍生物。最后此不饱和衍生物在(S)-BINAP-RuCl₂作用下发生不对称催化氢化反应得到(S)-N-Boc-哌啶酸。经过重结晶精制后的产物具有较高的光学纯度，收率为87％。化学合成L-哌啶甲酸过程复杂，合成L-哌啶甲酸的转化过程费用高，会造成大量的污染。随着人们环保意识和可持续发展意识的提高，生物法生产L-哌啶甲酸成了新的研究热点。一旦实现了L-哌啶甲酸生物合成的大规模生产，就可以替代目前的化学合成法，可以降低成本，减少环境污染。

与乳酸、乙醇等有机物发酵研究相比，L-哌啶甲酸发酵研究及文献报道相对较少。采用基因工程菌法制备L-哌啶甲酸主要是利用基因工程的方法将外源的基因克隆至宿主菌内，通过表达生产L-哌啶甲酸代谢途径中的各种酶，将L-赖氨酸转化为L-哌啶甲酸。目前，研究的最多的是重组大肠杆菌。在已构建好工程菌株的基础上，L-哌啶甲酸的生物制备方法包括全细胞催化法和微生物发酵法。