[发明专利]一种重组转氨酶及其应用

说明书

本发明公开了一种重组转氨酶及其应用。一种高活性的重组转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因如SEQ ID NO.1所示。一种制备所述的重组转氨酶的方法，包括发酵培养含有上述编码基因的基因工程菌，以及收集和制备重组转氨酶。本发明所述的重组转氨酶应用于不对称催化合成手性胺类化合物，特别是用于合成西他列汀中间体(R)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑丁酸甲酯。本发明所涉及的酶具有优良的对映体选择性和催化活力，且其催化的反应条件温和，反应转化率和产物的浓度高，易于大规模操作，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组转氨酶及其应用。

背景技术

生物催化是以酶或整体细胞为生物催化剂所进行的化学反应，具有反应条件温和、催化效率高、立体选择性好、副产物少、能耗低、催化剂无毒且可降解等绿色生物生产的典型特征，受到了广泛的关注和重视，也是各国科技与产业发展的战略重点。

光学纯手性胺是制备多种药物，如抗高血压药、抗抑郁药、抗癌药、抗真菌药物等及其中间体的重要手性砌块，其大规模制备具有较大的经济效益和应用价值。目前手性胺的主要制备方法包括化学合成、化学及酶法拆分以及酶催化合成，其中酶催化不对称合成方法更具优势。

转氨酶(transaminase)是不对称合成光学纯手性胺的关键酶，为辅酶磷酸吡哆醛(PLP)依赖型，在动、植物和微生物中分布广泛。其中ω-转氨酶是从前手性酮出发制备光学纯胺类化合物的高效催化剂，其强大的催化活力使其成为了不对称合成手性胺类化合物的重要选择之一一。

西他列汀是第一个用于治疗Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶(DPP-IV)抑制剂类药物，可抑制胰高血糖素的分泌和胰岛β细胞增殖及提高葡萄糖耐受水平，其降糖作用较为适中，不引起患者水肿及体重增加，导致低血糖的风险较小，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。西他列汀单独使用或与其他降糖药合用，均可达到降糖的目的。

酶催化合成西他列汀中间体具有反应条件温和、反应专一性强、副反应少、产物的收率和光学纯度高、产物容易分离纯化等优点，具有很好的应用前景。本发明开发了一种催化活性高、对映选择性好、底物和有机溶剂耐受性好的重组转氨酶，可用于催化合成手性胺化合物，特别是催化合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有优良的立体对映体选择性和催化活力的重组转氨酶，该转氨酶的编码基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其制备方法，以及该重组转氨酶突变体在催化制备手性胺化合物中的应用。特别的，将该重组转氨酶用于西他列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的制备。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种高活性的重组转氨酶突变体，以SEQ ID NO.3所示的基因编码的米曲霉(Aspergillus oryzaeRIB40)野生型转氨酶为出发酶；所述的重组转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中SEQ ID NO.3所示的核酸来源于米曲霉(Aspergillus oryzaeRIB40)。本发明所述SEQ ID NO.3所示的核酸可以从米曲霉(Aspergillus oryzaeRIB40)的基因组中分离获得，也可以从含有SEQ ID NO.3所示核酸的重组表达载体或者重组转化体中分离获得，也可以人工合成获得。

一种编码本发明所述的重组转氨酶突变体的基因，其核苷酸序列选自SEQ IDNO.1。

一种包含本发明所述的重组转氨酶突变体编码基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的重组转氨酶基因的核酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET21a。