[发明专利]一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种合成3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法和制备，属于基因工程领域和发酵工程领域，所述重组菌宿主菌为大肠杆菌，表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD和编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr。制备方法为：获得重组载体pETDuet‑clpP‑mcr、重组载体pACYCDuet‑accADBC；转化到宿主感受态细胞中。本发明解决了微生物发酵过程中，随着3‑羟基丙酸的浓度增加，抑制微生物生长影响产量的问题，相对于没有表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的菌株提高了116％，是已知的摇瓶发酵最高水平。

技术领域

本发明涉及一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

3-羟基丙酸作为一种平台化合物，是美国能源部公布的未来全球最具开发潜力的12种高附加值生物基化工产品之一，具有广阔的应用前景和很高的经济价值。3-羟基丙酸是一种三碳有机化合物，分子内含羧基和羟基，为乳酸的同分异构体，可作为多种有机物合成的前体物质，生产多种具有商业价值的化合物，如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸、丙内酯等，以上几种化学品每年的市场份额超过10亿美元。此外，它还是组成诸多大分子化合物和酯类聚合物的单体，可用于包装材料、金属润滑剂、纺织品抗静电材料、个人日常用品及可吸收医用材料等。目前我国的3-羟基丙酸全部依赖国外进口，国内市场售价高达8.5万元/吨。

目前，3-羟基丙酸的生产以化学合成为主，主要以丙烯酸、3-丙内酯、3-羟丙腈、醋酸乙烯酯和1，3-丙二醇为前体物质，通过一系列化工路线进行转化。化学合成方法具有生产成本较高而产率较低等缺点；同时，用于化学合成的前体物质大都具有毒性大、致癌性的特点，严重制约了产业化应用。生物转化法合成3-羟基丙酸的相关研究起步于近二十年，一些学者利用重组大肠杆菌(Escherichia coli)或肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)以甘油或葡萄糖为底物进行微生物转化。为有效提高3-羟基丙酸产量，转化技术路线也各有不同，研究主要集中于工程菌的构建和发酵工艺的改进。

3-羟基丙酸的生物合成技术虽然已经取得了一些进展，在产量和产率上取得了一定进步。但是，生物法生产3-羟基丙酸还存在诸多问题。其中，产物对菌体生长的抑制作用是制约3-羟基丙酸产量的主要因素之一。微生物发酵过程中，随着3-羟基丙酸的合成和积累，当3-羟基丙酸的浓度达到一定高度时，会抑制微生物的生长，阻碍3-羟基丙酸产量的进一步提升。

发明内容

为解决现有技术中，微生物发酵过程中，随着3-羟基丙酸的合成和积累，当3-羟基丙酸的浓度达到一定高度时，会抑制微生物的生长，阻碍3-羟基丙酸产量的进一步提升的问题，本发明首先提供了一种合成3-羟基丙酸的重组菌，所述重组菌宿主菌为大肠杆菌，表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD和编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr。

在本发明的一种实施方式中，所述的编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP和编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD来源于大肠杆菌，编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr来源于橙色绿屈挠菌。所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位ClcP在NCBI的蛋白质编号为YP_002406280.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccA在NCBI的蛋白质编号为WP_000055741.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccB在NCBI的蛋白质编号为WP_000354622.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccC在NCBI的蛋白质编号为WP_000884639.1，乙酰辅酶A羧化酶基因亚基AccD在NCBI的蛋白质编号为WP_000118404.1，丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI的蛋白质编号为AAS20429.1。