[发明专利]一种利用葡聚糖合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种利用葡聚糖合成3-羟基丙酸的重组菌，其特征在于：宿主菌为Klebsiellapneumoniae肺炎克雷伯氏菌，表达编码左旋葡聚糖激酶的基因lgk和编码醛脱氢酶的基因aldH；所述的编码左旋葡聚糖激酶的基因lgk来源于斯达油脂酵母，编码醛脱氢酶的基因aldH来源于荧光假单胞菌；所述编码左旋葡聚糖激酶的基因lgk在NCBI的核苷酸编号为KU377145.1，所述编码醛脱氢酶的基因aldH在NCBI的基因ID为11833876。

2.一种权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成密码子优化后的左旋葡聚糖激酶基因lgk，将所得基因与质粒puC18进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体puC18-lgk；

2)合成密码子优化后的醛脱氢酶基因aldH，将所得基因与步骤1)所得重组载体puC18-lgk进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体puC18-lgk-aldH；

3)将步骤2)所获得的重组载体puC18-lgk-aldH，转化到宿主Klebsiellapneumoniae感受态细胞中，获得重组菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述密码子优化后的左旋葡聚糖激酶基因lgk，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述密码子优化后的醛脱氢酶基因aldH，其序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种应用权利要求1所述的重组菌发酵生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步骤如下：

1)活化重组菌，获得种子液；

2)将步骤1)所得的种子液，与含有卡那霉素的发酵培养基，按照体积比种子液：发酵培养基＝(1～2):(100～130)的比例接种后，35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至OD₆₀₀在0.6～0.8，获得培养液；

3)向所得的培养液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.01～0.1mM，然后转入30～33℃、180～220rpm、pH＝7.0条件下继续培养24～48小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述培养条件为：37℃，180rpm。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源为葡聚糖，氮源为无机氮源，其他成分为无机盐。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的氮源为氯化铵和/或硫酸铵。

8.根据权利要求4～7任一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：20g/L葡聚糖，0.42g/L一水合柠檬酸，5.4g/L氯化铵，0.2g/L七水合硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素母液，加入pH＝7.0的磷酸钾缓冲液至磷酸钾终浓度100mmol/L；上述微量元素母液的配方为：5.0g/L六水合氯化铁，2.0g/L四水合氯化锰，0.684g/L氯化锌，0.476g/L六水合氯化钴，0.17g/L二水合氯化铜，0.062g/L硼酸，0.005g/L二水合钼酸钠，1％(v/v)浓硫酸。