[发明专利]一种工程菌及其用于制备睾丸酮的用途

说明书

本发明提供一种生产睾丸酮专用的可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌，所述工程菌为将睾丸酮乙酸酯水解酶基因通过表达载体转入宿主菌中或插入到宿主菌的染色体上，获得可表达睾丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。本发明还提供一种生产睾丸酮的方法。与现有技术相比，本发明的方法反应条件温和，并且在合成过程中，合成路线短，原料来源广，产率高且对环境污染小。产率可高达98％以上，能够有效率地制造作为医药和医药中间体在工业上有用的化合物‑睾丸酮。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种工程菌以及使用该工程菌制备睾丸酮的用途。

背景技术

甾体激素(Steroid hormone)，又称类固醇激素，是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核，有极高的医药价值。在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用。甾体激素是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质，1932年至1939年间，从腺体中获得雌酮(Estrone，1932年)、雌二醇(Estradiol，1932年)、睾丸酮(Testosterone，1935年)及皮质酮(Corticosterone，1939年)等的纯品结晶，之后又阐明了其化学结构，从此开创了甾体化学及甾体药物的新领域。随后，人们为扩大生产规模，降低成本，又以薯蓣皂苷(Diosgenin)为原料进行半合成生产甾体药物，使其成为医院临床使用不可缺少的药物。

微生物可以选择性地修饰或改造甾体化合物分子结构，这是通过微生物产生的酶催化进行的。1952年，美国普强药厂的生物化学家D.H.彼得森和微生物学家H.C.默里发现少根根霉能使孕酮的11碳位羟基化，生成11α-羟基孕酮，科学家们又相继发现细菌、真菌、放线菌中的某些种，可以使一定结构的甾体化合物在一定的部位上发生分子结构的改变。这种酶促反应具有严格的底物特异性，一般能使底物分子上1个或2个基团起反应。至今已发现微生物转化甾体化合物的反应类型几乎包括任何已知的微生物酶促反应和已经发现的化学反应，如氧化、还原、水解、缩合、异构化、新的碳碳键的形成以及杂基团的导入等。通常，一个酶促反应可以代替几个化学反应步骤，这就使甾体药物的合成工艺变得更有效并更经济。

睾丸酮(Testosterone)可简称睾酮(17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮)，结构式如式I所示，其是人体体内的基本激素，具有重要的药用价值。它能够加强肌肉的合成代谢，从而增加肌肉含量。此外，睾酮促进身体加速生产血红细胞，提升血液的给肌肉的供氧能力，达到加强肌肉力量及爆发力的效果。

目前有两种常用的睾丸酮制备方法：一是以薯蓣皂苷为原料经过十二步反应得到睾丸酮；二是以4AD(△^1,4-二烯雄甾酮-3,17-二酮)为原料，经过四步反应得到睾丸酮。上述两种方法均为化学方法，具有环境污染大，反应复杂等缺点。目前国内外也开始了对微生物转化制备睾丸酮的研究，但仍收效甚微。

因此，当前对用于生产高纯度的睾丸酮的方法仍存在需求。

发明内容

本发明的发明人发现，使用可以表达睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物，可以选择性地改造睾丸酮乙酸酯的结构。甾体化合物的微生物转化作用是利用微生物的酶对甾体底物进行特定的化学反应，基于此，本发明的发明人发现了一种使用睾丸酮乙酸酯为底物生产睾丸酮的方法。本发明的方法不仅能得到较高纯度的睾丸酮，而且进一步简化了生产工艺，并降低了生产成本。

本发明的目的是通过以下的方案实现的。

一方面，本发明提供了一种具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物在制备睾丸酮中的用途，其中所述微生物使用睾丸酮乙酸酯为底物。

优选地，所述微生物选自大肠杆菌、酵母菌、分枝杆菌、红球菌、假单胞菌和放线菌。

优选地，所述微生物包含编码具有睾丸酮乙酸酯水解酶活性的多肽的核苷酸序列；

更优选地，所述核苷酸序列具有或者为选自以下的核苷酸序列：