[发明专利]肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法

权利要求书

1.一种肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：

所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；

(2)动物肉的预处理：

生肉和熟肉不做预处理，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；

(3)、掺假牛肉的制备：

A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉捣碎混合均匀，得非标混合肉；

B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉(纯牛肉)与非标混合肉按不同质量百分比混合均匀，制成不同比例的掺假牛肉；

(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作为样品，分别加入蛋白提取液，混悬后冰浴，离心，孵育，取出冷却至室温，测定吸光度值；

(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作样品，分别加入蛋白提取液，匀浆，冰上孵育，重复3次；在冰上静置后加入预冷的丙酮，震荡摇匀，静置，再离心，弃上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗涤，将固体残渣挥去溶剂；然后用尿素/碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入DTT储备液反应，然后加入IAA储备液避光反应；加入碳酸氢铵溶液，计算肉蛋白浓度，加入Trypsin，酶切过夜，取出，加入甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；

(6)、净化除盐：HLB柱依次用甲醇、水活化，将动物肉多肽溶液离心，分别取上清液上载至HLB柱中，待样液全部流出后用水淋洗，使柱体保持抽干，再用甲醇洗脱，将收集的洗脱液于氮气流下浓缩至干，加入乙腈-甲酸溶解残渣，涡旋混匀，超声，过滤净化除盐；

(7)、上液相色谱-四级杆串联质谱测定动物肉中特征多肽：方法是，净化除盐后的动物肉多肽溶液上液相色谱-四级杆串联质谱测定，在高分辨质谱扫描、Maxquant、Sieve数据分析的基础上得到的特征多肽信息，LC-MS/MS方法首先在子离子扫描模式下，以HPLC-Q/Exactive中筛选出带2个或3个的电荷离子为母离子进行全扫描，获得特征子离子，以特征子离子对作为肉蛋白多肽标志物进行定性与定量分析，从而实现牛肉掺伪鉴别。

2.根据权利要求1所述的肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、肉类的制备：

所述的肉类为牛肉、马肉、猪肉、兔肉、鸡肉、鸭肉，其中：

生鲜肉：将市场购得的生鲜肉切成小块置于-80℃冰箱中冷冻；

熟肉：将生鲜肉在190℃加热1h，成熟肉，真空至干；

肉制品：煎炸肉：将生鲜肉放入高温植物油油中煎炸5min，取出后冷却至室温；腌肉：将生鲜肉加入氯化钠腌制24h，取出后用清水清洗，真空至干；肉肠：将生鲜肉中按常规方法加入辣椒面、花椒粉、白酒，装肠；肉泥：将生鲜肉加入20％氯化钠，4℃腌制4天，加水放置加热板上加热搅拌20min，再于高压蒸锅121℃蒸制15min；

(2)动物肉的预处理：

生肉和熟肉不做预处理，肉制品每2g用体积浓度95％乙醇洗2次，每次20mL，再用乙醚洗2次，每次10mL，然后将溶剂蒸发干，置于-80℃冰箱中；

(3)制备掺假牛肉：

非标混合肉的制作：取非标准肉各100g于组织捣碎机中混合均匀，制得非标混合肉，装入密封样品袋中保存；

所述的非标准肉为猪肉、马肉、兔肉、鸡肉、鸭肉；

制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉(纯牛肉)与非标混合肉混合均匀，制成掺假质量比例分别为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％的掺假牛肉；

(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品100g作为样品，分别加入1000μL蛋白提取液，混悬后冰浴10min，4℃下13000r/min转速下离心10min，37℃孵育30min，取出冷却至室温，于562nm波长下，用酶标仪测定吸光度值；

所述的蛋白提取液是：取50mL 1M TrisHCl，37.5mL 4M NaCl，4mL 0.5M EDTA，10mL NP-40，10mL 10％SDS，用水定容至1000mL；

测定蛋白浓度的计算公式为：

取10次样品测定的平均数，见下表1：

表1 肉平均蛋白浓度(n＝10)

(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品300mg作样品，分别加入1000μL蛋白提取液，以匀浆机上最大速度匀浆20s，在冰上孵育40s，重复3次；在冰上静置10min，然后加入样品3倍体积的-20℃冰箱预冷过夜的丙酮，震荡摇匀，-20℃静置2h，再在15000r/min离心10min，弃掉上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗3次，将固体残渣通风自然挥发掉多余的溶剂；然后用200μL的8M尿素/50mM碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入1M的DTT储备液使浓度保持在10mM，在56℃下反应40min，然后加入0.5M的IAA储备液使浓度保持在50mM，常温下避光反应40min；加入200μL碳酸氢铵溶液，根据步骤(4)计算公式1得到的肉蛋白浓度，按Trypsin浓度：蛋白浓度＝1:20的比例加入Trypsin，37℃恒温培养箱中酶切过夜，取出，加入2μL甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；

所述的1M的DTT储备液是：称取0.154g二硫代苏糖醇，加入1mL水溶解，配制成1mol/L二硫代苏糖醇水溶液；

所述的0.5mol/L的IAA储备液是：称取0.185g碘乙酰胺，加入0.5mL水溶解，配制成0.5mol/L的碘乙酰胺母液；

所述的50mM碳酸氢铵溶液是：称取碳酸氢铵0.395g加入100mL水混匀制成；

所述的8M尿素溶液是：称取48.05g尿素，0.395g碳酸氢铵，加水溶解，定容至100mL制成；

所述的Trypsin浓度为1μg/μL，制备方法是，将100μL 1mmol/L盐酸加入到含有100μg胰蛋白酶冻干粉的离心管中，混匀；

(6)、净化除盐：HLB柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将动物肉多肽溶液离心，分别取上清液上载至HLB柱中，待样液全部流出后用3mL水淋洗，使柱体保持抽干5min，再用5mL甲醇洗脱，将收集的洗脱液于氮气流下浓缩至干，氮吹仪水浴温度保持40℃，加入体积比1:9的1mL乙腈-0.1％甲酸溶解残渣，涡旋混匀3min，超声5min，经0.2μm滤膜过滤净化除盐；

所述体积比1:9的乙腈-0.1％甲酸的甲酸水溶液是：量取1mL甲酸加入1000mL水中配制成0.1％的甲酸水溶液，取10mL乙腈与90mL0.1％的甲酸水溶液混匀，于0℃-4℃保存；

(7)、上液相色谱-四级杆串联质谱测定动物肉中特征多肽：方法是，净化除盐后的动物肉多肽溶液上液相色谱-四级杆串联质谱测定；

液相条件：

液相色谱柱：CAPCELL PAK MG2(150mm×2.1mm,5μm)；柱温：35℃；流动相：0.1％甲酸乙腈A与0.1％甲酸水溶液B；梯度洗脱程序：0min，20％A相和80％B相；7min，40％A相和60％B相；8min，90％A相和10％B相；10min，90％A相和10％B相；10.1min，20％A相和80％B相；14min，20％A相和80％B相；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；

质谱条件：

电喷雾离子化方式下正电离(ESI+)；雾化气：413.7kPa(60psi)；气帘气；172.4kPa(25psi)；喷雾电压：5000V；去溶剂温度：550℃；去溶剂气：344.8kPa(50psi)；碰撞气：69kPa(10psi)，每个离子对驻留时间：10ms，去簇电压(DP)：80V，每种化合物的检测离子对、碰撞室出口电压(CXP)、射入电压(EP)、碰撞能量(CE)的质谱参数见表2；

表2 质谱参数

在高分辨质谱扫描、Maxquant、Sieve数据分析的基础上得到的特征多肽信息见表3：

表3 特征多肽的保留时间和精确分子量

LC-MS/MS方法首先在子离子扫描模式下，以HPLC-Q/Exactive中筛选出带2个或3个的电荷离子为母离子进行全扫描，获得特征子离子，以特征子离子对作为肉蛋白多肽标志物进行定性与定量分析，从而实现牛肉掺伪鉴别。