[发明专利]土壤细菌高通量绝对定量方法

说明书

本发明公开了一种土壤细菌高通量绝对定量方法，包括以下步骤：1)、将E.coli HTAQ‑GFP菌体，涡旋重悬于无菌水中，调节菌悬液在紫外分光光度计OD_600nm＝1.0；2)、对内标菌株HTAQ‑GFP进行绝对定量，获得菌液中内标菌株E.coli HTAQ‑GFP绝对含量；3)、添加内标菌株HTAQ‑GFP菌液至土样并搅拌混匀；4)、提取土壤DNA，进行16S rRNA基因扩增子高通量测序，获得细菌群落结构分类组成信息及对应相对丰度；5)、根据内标菌株HTAQ‑GFP绝对含量及高通量测序结果中Escherichia相对丰度计算获得土壤土著细菌总量及各分类单元的绝对含量。

技术领域

本发明属于土壤微生物领域，涉及一种集高通量测序平台与细菌内标法于一体的土壤细菌高通量绝对定量技术。

背景技术

土壤中微生物数量庞大，种类繁多，在地球物质循环、工农业生产乃至医学领域等均发挥了不可或缺的作用。研究特定生态环境中微生物群落结构演替进程，获取其种类及数量变化信息，对于进一步阐释与利用微生物生化机理、保护微生物资源和多样性具有重要意义。

自列文虎克首次通过显微镜观察到微生物的存在后，多种用于探究微生物微观世界的方法应运而生。现有技术有土壤细菌定量法：染色-荧光显微镜计数法、平板培养计数法、氯仿熏蒸生物量碳氮测定法、实时荧光定量PCR法等，以及土壤细菌群落研究方法：磷脂脂肪酸(PLFA)分析技术、高通量测序技术等。其中，平板培养计数法或可满足同时获取微生物种类及数量信息的要求，但环境中仅有1％-3％的微生物可采用该技术培养出；高通量测序技术可满足大量获取微生物群落结构分类信息的要求，却局限于以相对丰度表征物种含量。在同一群落结构中，相对丰度表征的是一个物种在该群落结构中的优势程度，却不能以此推测该物种在时间尺度及空间尺度上(跨样本)的增长与减少。

受技术限制，长期以来，学者们仅能以相对丰度替代表征微生物的增减来开展研究，为更为精确地表示微生物的数量变化，急需开发一种既能获得微生物群落分类信息又能获得细菌群落绝对含量组成的技术，弥补现有方法的缺陷，对进一步研究微生物生态学具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种土壤细菌高通量绝对定量方法；本发明解决了现有技术的不足，以微生物中细菌域为例，提供一种适用于土壤细菌高通量绝对定量的技术，有利于完善土壤细菌数量生态学的研究，从而进一步研究利用土壤细菌。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种土壤细菌高通量绝对定量方法，包括以下步骤：

1)、内标菌株获取：

将E.coli HTAQ-GFP菌体(离心获取过夜培养E.coli HTAQ-GFP菌体)，涡旋重悬于无菌水中，调节菌悬液在紫外分光光度计OD_600nm＝1.0(此时菌体浓度约为5×10⁸CFU mL^-1)；

2)、内标菌株绝对定量：

采用荧光显微镜或平板计数法对内标菌株HTAQ-GFP进行绝对定量，获得菌液中内标菌株E.coli HTAQ-GFP绝对含量；

3)、添加内标菌株HTAQ-GFP菌液至土样(添加浓度为10⁶cells g^-1左右)并搅拌混匀，搅拌时将盛土容器置于冰浴上；

4)、提取土壤DNA，进行16S rRNA基因扩增子高通量测序，获得细菌群落结构分类组成信息及对应相对丰度(门、纲、目、科、属)；

5)、根据内标菌株HTAQ-GFP绝对含量及高通量测序结果中Escherichia相对丰度计算获得土壤土著细菌总量及各分类单元(门、纲、目、科、属)的绝对含量。

作为本发明的土壤细菌高通量绝对定量方法的改进：