[发明专利]利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质的方法

权利要求书

1.一种转化陆地棉的表达载体pHellsgate 4，其特征在于：所述的表达载体包含有SEQID NO：1所述的核苷酸序列。

2.表达AsFAR基因双链RNA的转基因棉花在抵抗中黑盲蝽中的应用，其特征在于所述应用包括下列步骤：

(1)在AsFAR基因保守区域内选择一个长度为432bp的cDNA片段并用PCR方法进行基因克隆，将这一序列与RNAi表达载体pHellsgate 4连接后转化棉花植株,所述的转化步骤为：

1)将含有AsFRA基因的载体导入到农杆菌菌株EHA105；

2)挑选饱满、健康的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡8-12min，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的无菌外植体棉花种仁接种于无菌苗培养基中，一天后扶苗，去种皮，5天后得到无菌苗下胚轴；

3)取无菌苗下胚轴作为外植体，用解剖刀切成0.5-0.8cm的小段接种于经农杆菌活化培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染5mim后，将外植体转移到无菌滤纸上吸干残留菌液并吹10min使外植体表面稍微干燥；

4)将无菌苗下胚轴接种在含有共培养培养基的培养皿中，于21℃下共培养48h，将无菌苗下胚轴转移至选择培养基中，每一个月继代培养一次直到获得胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转入分化培养基中培养获得胚状体；

5)将根生长受到抑制的再生幼苗转移至生根培养基上，促进其生根；

6)对转基因后代进行阳性鉴定，鉴定所用的引物序列如下：

AsFAR-F:5’-CGAATGGTTGAAAGAAAATAGG-3，

AsFAR-R:5’-TTGGTGAAAGTGTAGGTGTTGG-3’；

7)提取转基因植株总RNA并反转录，以cDNA为模板通过荧光定量PCR对目的基因

的表达量进行检测，扩增用的引物序列如下：

Q-RT-AsFAR-F：5'-CATCAACTGAACAAAATCGTGG-3'，

Q-RT-AsFAR-R：5'-TATGCGGTGGAGACGTGAAC-3'；

8)使AsFAR基因在转基因棉花中表达；

9)对转基因棉花作抗虫鉴定；

上述步骤(1)至(5)中培养基的配制：

无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L Phytagel；

愈伤组织诱导培养基：MSB，附加24-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％

Phytagel；

农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.25g/L，

甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L；调pH至5.8；

共培养培养基：MSB，附加24-D 0.1mg/l，KT 0.1mg/l，50mg/l AS，3％Glucose，0.25％。

Phytagel，调pH至5.85-5.95；

选择培养基：MSB，附加2，4-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，

卡那霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，pH 5.85-5.95；

分化培养基：去掉NH4NO3、并将KNO3加倍的MSB，附加IBA 0.5mg/L，KT 0.15mg/L，

3％Glucose，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，0.25％Phytagel，调pH至5.85-5.95；

生根培养基：1/2MSB，附加Gln 0.5g/L，Asn 0.25g/L，1.5％Glucose，0.25％Phytagel,调pH至6.1；

MSB的成分：MS培养基+，附加B5的维生素。