[发明专利]一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法

说明书

本发明提供一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法，其中使用的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明利用基因改造的重组褐藻胶裂解酶，定向制备褐藻胶寡糖，与现有酸法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，克服了破坏性大、效率低的缺点，与现有的酶法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，运用改造的重组褐藻胶裂解酶，克服了酶解时间长、成本高、不能定向制备特定聚合度的褐藻胶寡糖的缺点。本发明过程简单、成本低且适用于工业化生产，能够在短时间内降低褐藻胶粘度，所制寡糖的总得率在90％以上。所制备的褐藻胶寡糖有抗肿瘤、抗炎、降血脂和提高免疫力等功效，可用于食品及保健品领域，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于褐藻胶寡糖制备技术领域，具体涉及一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法。

背景技术

褐藻胶寡糖(alginate oligosaccharides)是褐藻胶经水解而得到的聚合度小且水溶性好的低分子量片段。由于褐藻胶寡糖具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等多种生理活性，可广泛应用在食品、医药及化妆品等领域，具有巨大的应用和开发价值。最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻胶寡糖的制备方法主要有酸法水解和酶法水解。酸法水解会不同程度破坏褐藻胶寡糖的结构，而酶法水解具有反应条件温和等优点，因此，酶法水解制备褐藻胶寡糖受到广泛关注。海洋微生物是褐藻胶裂解酶的重要来源，一些褐藻胶裂解酶相继从弧菌、交替单胞菌、假交替单胞菌中分离出来。但由于海洋环境的特殊性，导致海洋微生物产生的褐藻胶裂解酶活性有限、不能定向制备褐藻胶寡糖。因此，寻找专一性强、活力高的褐藻胶裂解酶仍是研究者关注的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法，通过改造后的酶能够高效、定向地制备目标褐藻胶寡糖，解决现有技术存在的效率低、不能定向制备褐藻胶寡糖的缺点。

本发明首先提供一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法，包括如下的步骤：

1)底物配制：将褐藻胶原料与水混合，配制成浓度为5％-8％的pH值为中性的酶解底物溶液；

2)分步酶解：加入褐藻胶裂解酶，于40-50℃下搅拌酶解1-2h，再次加入0.3％-0.8％的褐藻胶裂解酶，搅拌酶解，总酶解时间为2-4h；

3)低聚糖制备：酶解结束后，过滤或离心除去渣子，上清液浓缩、冷冻干燥得到海藻低聚糖。

上述的方法中，其中褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

为了获得聚合度更为集中的褐藻胶寡糖，本发明对褐藻胶裂解酶进行了优化，优化后的褐藻胶裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；

本发明所提供的优化的，能定向制备褐藻胶寡糖的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MKVSCAVVLSACIASANADNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPIDGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYALEQSHD；

编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:4: