[发明专利]基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及应用。

背景技术

1968年Mebus等人发现了牛轮状病毒，而牦牛轮状病毒(Yak RV)于1986年在张敏等对牦牛的腹泻病研究中首次发现并分离得到，但是却没有进行进一步的研究(张敏，王清江，刘登薇，等.红原牦牛轮状病毒的研究[J].四川畜牧兽医,1986,3:2-4.)。1990年，李明瑞等在兰州的犊牦牛腹泻中发现牦牛轮状病毒的存在，并证明牦牛轮状病毒是引起牦牛腹泻的重要病因(李明瑞，李春玲，李浩，等.1990.牦犊牛流行性腹泻病原的调查[J].中国兽医科学(2)，12-13.)。被牦牛轮状病毒感染的犊牦牛临床症状主要是腹泻，常继发细菌感染，引起死亡，病死率高。给牦牛养殖业带来了巨大的经济损失。

引起牦牛腹泻的病原较多，包括轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、隐孢子虫以及球虫等，症状相似，较难区分，故早期的鉴别诊断尤为重要，病原检测可以提供感染的直接证据，是最可靠的诊断手段，PCR、荧光定量PCR是最为常用的病原学检测手段，尤其荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，已经成为动物疫病诊断的主流手段。但是普通的荧光定量PCR方法由于需要大型设备、操作复杂、反应时间长等因素制约了其在现场快速检测方面的应用。

同时，由于青藏高原的特殊环境导致了牦牛轮状病毒基因发生了很大的变异，特别是常作为靶标基因的VP6基因，2016周芳等研究表明牦牛轮状病毒VP6基因的变异严重影响现有PCR方法的检出率(周芳，岳华，张斌，等.2016.牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用[J].畜牧兽医学报，47(7)，1465-1473.)。因此针对牦牛轮状病毒建立一种快速、敏感、特异、适用于现场的检测方法迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及应用，本发明是基于恒温隔绝式荧光PCR的一种简单、快速、灵敏度高和特异强的检测方法，可以现场对牦牛轮状病毒的检测提供科学依据，对保障牦牛养殖业健康发展具有重要意义。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测的引物和探针，所述引物和探针包括：牦牛轮状病毒上游引物和牦牛轮状病毒下游引物和牦牛轮状病毒探针，其中，

所述牦牛轮状病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。

本发明还公开了一种上述引物和探针在制备牦牛轮状病毒检测试剂盒方面的应用。

本发明还公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒，包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管；

所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1μL、反转录酶1.25μL、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物各3.5μL和牦牛轮状病毒探针0.25μL、dNTPs 4μL；

牦牛轮状病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。

进一步地，Taq酶的终浓度为5U·μL^-1，反转录酶的终浓度为20U·μL^-1，牦牛轮状病毒上游引物和牦牛轮状病毒下游引物的终浓度均为10μmol·μL^-1，牦牛轮状病毒探针的终浓度为10μmol·μL^-1，dNTPs的终浓度为2.5mM。

进一步地，所述荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到：将Taq酶、反转录酶、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物和牦牛轮状病毒探针、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管，制得荧光定量PCR反应液冻干管，所述荧光定量PCR反应液冻干管设置有50管。