[发明专利]一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法

说明书

本发明公开了一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法，收集新鲜外周血后加入含有抗凝剂的采血容器中，封口后于4‑30℃保存，所述采血容器的容积不小于外周血和抗凝剂总体积的1.5倍；将外周血加入含有抗凝剂的采血容器后，用添加氩气的混合空气将采血容器中的剩余空气置换后再封口；混合空气中，空气与氩气的体积比为100:4‑8。本发明提供的血液抗凝和保存方法可以保证采血后24h内进行单个核细胞收集和CIK细胞培养不会造成CIK细胞增殖效率无明显降低，为医疗机构和医务工作者留有足够弹性时间。

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，涉及CIK细胞培养，具体涉及一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法。

背景技术

细胞过继免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要方法之一，在多种免疫活性因子的作用下，通过体外培养可以消除肿瘤患者体内的免疫抑制因素，有效活化和扩增免疫活性细胞，回输体内后可直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞。过继免疫治疗有很多优越性，其免疫细胞在体外处理，可绕过体内免疫障碍的种种机制，从而选择性地激发抗肿瘤免疫应答。另外，在体外培养条件下，对肿瘤抗原耐受的免疫细胞可被逆转。目前，基因工程可大量克隆不同细胞因子及抗原多肽，使体外活化扩展大量抗肿瘤免疫细胞更为方便，避免一些制剂体内大量应用带来的严重副反应。因此，过继免疫治疗成为近年来肿瘤免疫治疗中的热点，为晚期患者开辟了新的治疗途径。但作为一种新的治疗手段，治疗方案及标准尚待进一步规范和统一，应用时机及途径等问题尚需进一步探讨。

常用于细胞免疫治疗的细胞包括细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞等。其中，CIK细胞是一种经体外诱导培养形成的具有肿瘤细胞杀伤活性的NK样T细胞，其克服了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润细胞(TIL)等细胞增殖能力差、对肿瘤细胞毒性低的缺点，能满足临床治疗的要求。CIK细胞培养简单，将单个核细胞在体外培养，有序地添加IFN-γ、抗CD3单克隆抗体、IL-1α、IL-2进行诱导，2～3周以后即可收获大量具有强细胞毒性的效应细胞。此外，在培养过程中添加其他外源刺激因子，如IL-15、IL-21、CD137单抗、抗胸腺细胞球蛋白等，可以增强CIK细胞的扩增能力或对肿瘤的细胞毒性。

单个核细胞通常取自自体外周血。虽然研究表明，采血后24h内均可收集单个核细胞用于CIK细胞培养，但保存时间越长，增殖效率越差，超过8h，将会影响CIK细胞培养16d之后的增殖效率(王宇环等，细胞与分子免疫学杂志，2016年第3期)。

但是，临床上，由于人力和设备紧张，尤其在突发状况下，常常不能保证在采血后的8小时内完成单个核细胞的收集和培养，一定程度上降低了CIK细胞的培养效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法，以保证采血后24h内进行单个核细胞收集和CIK细胞培养不会造成CIK细胞增殖效率明显降低，为医疗机构和医务工作者留有足够的弹性时间。

实现本发明上述目的技术方案如下：

提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法，收集新鲜外周血加入含有抗凝剂的采血容器中，封口后于4-30℃保存，将外周血加入含有抗凝剂的采血容器后，用添加氩气的混合空气将采血容器中的剩余空气置换后再封口；混合空气中，空气与氩气的体积比为100:4-8。

优选地，保存期间，每1-3小时轻轻将采血容器往复颠倒1次，操作后采血容器的状态恢复至初始状态。

优选地，所述采血容器的容积不小于外周血和抗凝剂总体积的1.5倍。

优选地，采血容器的容积与外周血和抗凝剂总体积的最小倍数P取决于封口后保存时间t，二者满足如下公式：

p＝k×(t-8)+1.5