[发明专利]一种检测靶核酸序列的方法

权利要求书

1.一种检测n种靶核酸序列在样品中的存在的方法，其中，n为≥2的整数，并且，所述方法包括以下步骤：

(1)针对待检测的每一种靶核酸序列，提供一种上游寡核苷酸序列和一种媒介子探针；其中，所述上游寡核苷酸序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游寡核苷酸序列位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

并且，在允许核酸杂交的条件下，将所述样品与所提供的上游寡核苷酸序列和媒介子探针接触；

(2)在允许切割媒介子探针的条件下，将步骤(1)的产物与具有5'核酸酶活性的酶接触；

(3)提供m种检测探针，并且在允许核酸杂交的条件下，将步骤(2)的产物与所述m种检测探针接触，其中，

m为小于n且大于0的整数，并且

每一种检测探针各自独立地从3'至5'方向包含，与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列(templating sequence)；并且，所述m种检测探针包含至少n种捕获序列，其分别与步骤(1)中提供的n种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，

每一种检测探针各自独立地标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，并且，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；并且，每一种检测探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号；并且，

(4)在允许核酸聚合酶进行延伸反应的条件下，将步骤(3)的产物与核酸聚合酶接触；

(5)对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中。

2.权利要求1的方法，其中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数。

3.权利要求1的方法，其中，m小于n且为≥2的整数。

4.权利要求3的方法，其中，所述m种检测探针各自标记有不同的报告基团。

5.权利要求3的方法，其中，m为≥5的整数。

6.权利要求3的方法，其中，m为≥8的整数。

7.权利要求3的方法，其中，m为≥10的整数。

8.权利要求1的方法，其中，m为1、2、3、4、5或6。

9.权利要求1的方法，其中，步骤(1)提供了2种、3种、4种、5种、6种、8种、10种、15种、20种、25种、30种、35种、40种、45种或更多种媒介子探针；并且，步骤(3)提供了1种、2种、3种、4种、5种、6种、8种、10种或更多种检测探针。

10.权利要求1的方法，其中，所述m种检测探针包含相同的报告基团；并且，在步骤(5)中，对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析，并根据所获得的熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在。

11.权利要求1的方法，其中，所述m种检测探针所包含的报告基团彼此不同；并且，在步骤(5)中，在对步骤(4)的产物进行熔解曲线分析时，分别实时监测每一种报告基团的信号，由此获得各自与一种报告基团的信号对应的多条熔解曲线；随后，根据报告基团的信号种类以及熔解曲线中的熔解峰(熔点)来确定某一种靶核酸序列的存在。

12.权利要求1的方法，其中，m＝1，并且n为≥2的整数。