[发明专利]精子顶体酶的快速提取方法及其活性的流式检测方法

权利要求书

1.一种精子顶体酶的快速提取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将含有7.5*10⁶个精子数目的精液加入到离心管中，于10000rpm离心2min，吸去离心后管内的精浆部份，保留下层精子沉淀；

(2)在含有精子沉淀的离心管中加入200uL破膜液，使精子沉淀团均匀悬浮后，于7000rpm离心2min后，去掉上清，然后加入400uL提取液，使精子于37℃悬浮10min，再于12000rpm离心3min后，收集上清，即获得顶体酶提取物，其中每100ml破膜液中含磷酸二氢钠1.2g，Triton-100 0.2-0.4ml和叠氮钠0.05g；每100ml提取液中含BSA 1g、氯化钠0.35g、磷酸一氢钠1.19g、二水磷酸二氢钠0.25g和叠氮钠0.05g，其中破膜液的配制方法如下：准确称量磷酸二氢钠1.2g、叠氮钠0.05g和0.2-0.4ml Triton-100溶于80亳升去离子水中，用1N HCl调节pH至4-6后，用去离子水定容至100毫升，用0.22微米的滤膜过滤后即得到破膜液，所述的提取液的配制方法如下：准确称量牛血清白蛋白(BSA)1g，氯化钠0.35g，磷酸一氢钠1.19g，二水磷酸二氢钠0.25g和叠氮钠0.05g，溶于80亳升去离子水中，用1N氢氧化钠调pH至7.0-8.0，然后用去离子水定容至100亳升，用0.22微米的滤膜过滤后即得到提取液。

2.一种精子顶体酶活性的流式检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)收集样本：将新鲜采集、液化完全的精子样本通过精子计数仪计数后，取7.5*10⁶个精子数目的精液，于10000rpm离心2min，用枪头吸弃上清，留下精子样本沉淀待用；

(2)裂解细胞：向步骤(1)中得到的精子细胞沉淀里加入200uL破膜液，用枪头上下吹打细胞，使精子细胞充分重悬，将重悬液7000rpm离心2-4min后，用枪头吸去上清液，留下沉淀待用，其中所述的破膜液配方为：每100ml破膜液中含磷酸二氢钠1.2g，Triton-100 0.2-0.4ml和叠氮钠0.05g；

(3)溶解顶体酶：向步骤(2)中的沉淀细胞团里加入400uL提取液，用枪头上下吸打，充分混匀沉淀，在37摄氏度金属浴上孵育10min后，12000rpm离心2min，吸取上清液即为顶体酶提取液；其中所述的提取液配方为：每100ml提取液中含BSA 1g、氯化钠0.35g、磷酸一氢钠1.19g、二水磷酸二氢钠0.25g和叠氮钠0.05g；

(4)酶切荧光微球：吸取步骤(3)中得到的顶体酶提取液100uL，加入100uLPB缓冲溶液，再加入含有5*10⁴个顶体酶底物荧光微球的溶液，使酶切体系为250uL，24摄氏度孵育1小时后，加入终止剂终止反应1-2min；

(5)流式检测：将步骤(4)中酶切反应后的混合液在流式细胞仪上进行检测；

(6)酶活计算：根据流式细胞仪上得到的荧光值，计算荧光衰减率，根据酶活衰减率标准曲线y＝0.0001X²+0.0355X+67.324，计算获得顶体酶的酶活，其中y代表顶体酶酶活性，单位为μIU，X代表荧光衰减率。

3.根据权利要求2所述的精子顶体酶活性的流式检测方法，其特征在于步骤(4)中所述PB缓冲溶液的配方为：0.1M NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH值为7-8，配置好的缓冲液用0.22微米的滤膜过滤。

4.根据权利要求2所述的精子顶体酶活性的流式检测方法，其特征在于步骤(4)中所述的终止剂是含有苯甲脒的去离子水溶液，每100ml终止液中含有17.46g苯甲脒。

5.根据权利要求2所述的精子顶体酶活性的流式检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的顶体酶底物荧光微球包括直径为微米级的微球，所述的微球上偶联有能被顶体酶酶切的多肽或蛋白质，所述的多肽或蛋白质标记有荧光分子基团，所述的荧光分子基团在流式细胞仪上被激发光照射后发射出的荧光能够被流式细胞仪所检测。

6.根据权利要求5所述的精子顶体酶活性的流式检测方法，其特征在于：所述的微球的材质为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化硅、聚乳酸或聚乳酸羟基乙酸聚合物；所述的多肽是指含有能够被顶体酶识别的精氨酸或赖氨酸的多肽，所述的蛋白质是指含有能够被顶体酶识别的精氨酸或赖氨酸的蛋白质。