[发明专利]一种检测人类ESR1基因突变的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人类ESR1基因突变的试剂盒。该试剂盒包括组分甲和/或组分乙和/或组分丙；组分甲包括封闭序列甲和引物对甲(由上游引物F1和下游引物R1组成)；组分乙包括封闭序列乙和引物对乙(由上游引物F2和下游引物R2组成)；组分丙包括封闭序列丙和引物对丙(由上游引物F3和下游引物R3组成)；封闭序列甲、上游引物F1、下游引物R1、封闭序列乙、上游引物F2、下游引物R2、封闭序列丙、上游引物F3和下游引物R3的核苷酸序列依次如序列表中的序列2、序列3、序列4、序列6、序列7、序列8、序列10、序列11和序列12所示。该试剂盒检测人类ESR1基因突变，准确率高，灵敏度高，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测人类ESR1基因突变的试剂盒。

背景技术

雌激素受体(estrogen receptor，ER)包括两大类：一是经典的核受体，包括雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)和雌激素受体β(estrogen receptorβ，ERβ)，均位于细胞核内，介导雌激素的基因型效应，即通过调节特异性靶基因的转录而发挥基因型调节效应；二是膜性受体，包括经典的核受体的膜性成分以及属于G蛋白偶联受体家族的GPER1(GPR30)、Gaq-ER和ER-X，可介导快速的非基因型效应，通过第二信使系统发挥间接的转录调控功能。ER的作用是为对生殖系统发育和生殖功能有重要影响的雌性激素提供结合位点。ER结合雌性激素后，导致基因表达并控制信号通路的激活，从而调节细胞生长过程，控制细胞周期。ESR1基因位于人类染色体6q25.1区域，全长472929bp，编码ERα。

已有文献记载，在ER阳性乳腺癌患者中，ESR1基因的原发性变异比例约为0.5％，经过一些内分泌疗法如芳香酶抑制剂(aromatase inhibitors，AI)等药物治疗后产生继发性耐药突变，比例高达20％。ESR1基因的耐药突变以错义突变为主，通过氨基酸残基的变化而影响其结构与功能，引起非雌激素依赖的下游通路持续激活，从而使得ER阳性肿瘤细胞持续生长，导致了内分泌治疗药物的失效，产生耐药性。ESR1基因变异频率较高的位点有S463P﹑V534E﹑P535H﹑L536R/Q﹑Y537S/N/C及D538G等，主要位于ER的配体结合区(ligandbinding domain，LBD)。D538G变异使ESR1基因第538位编码子天冬氨酸变为甘氨酸，该位点是ESR1基因常见的变异热点，该位点突变可增加对他莫西芬、氟维司群等的耐受。

ESR1基因突变分析可以指导进一步的内分泌治疗，并具有临床实用性。例如，研究表明对于ESR1基因突变的患者，ER拮抗剂氟维司群(fulvetrant)依然有效；氟维司群已被FDA批准用于ER阳性的晚期乳腺癌治疗，可直接作用于ER，通过抑制ESR1突变的ERα转录达到抑制肿瘤的作用。临床试验显示，服用氟维司群的患者疾病进展时间为6.8个月，客观响应率为31.6％。III期临床试验证明，ER阳性的晚期乳腺癌患者服用氟维司群后，无进展期为6.9个月，中位总生存期为26.4个月。

目前用于基因突变检测的方法有Sanger测序法、高分辨率溶解曲线检测法、高效液相色谱法、ARMS-PCR法、二代测序等。已报道的应用于检测ESR1突变的方法主要有Sanger测序技术、ARMS-PCR技术和二代测序技术。其中Sanger测序技术成本低，是突变检测的金标准，但是该方法灵敏度不足，仅能检测10％以上的突变，不能满足血浆中微量游离核酸突变的检出。二代测序技术灵敏度高，但其依赖于昂贵的仪器和分析软件，检测周期长，且成本大大增加，难以在临床检测中普遍开展。目前比较常用的是ARMS-PCR法，即扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system ARMS)于1989年建立，该方法灵敏度高，特异性好，但是检测位点过多造成检测成本的增加以及操作的繁琐，并且ARMS-PCR只可用于对已知突变基因进行检测。因此，需要建立一种灵敏、快速有效、能一次检测多个突变位点的ESR1基因突变检测方法。

发明内容