[发明专利]一种检测人类KRAS基因突变的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人类KRAS基因突变的试剂盒。该试剂盒包括组分甲和/或组分乙；组分甲包括封闭序列甲和引物对甲；组分乙包括封闭序列乙和引物对乙；封闭序列甲和封闭序列乙均为单链DNA分子，其中若干核苷酸发生了锁核酸修饰；引物对甲由上游引物F1和下游引物R1组成；引物对乙由上游引物F2和下游引物R2组成；封闭序列甲、上游引物F1、下游引物R1、封闭序列乙、上游引物F2和下游引物R2的核苷酸序列依次如序列表中的序列2、序列3、序列4、序列6、序列7和序列8所示。实验表明，采用本发明提供的试剂盒检测人类KRAS基因突变，准确率高，灵敏度也较高，从而大大的降低了检测的假阴性率，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测人类KRAS基因突变的试剂盒。

背景技术

目前，靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要作用靶点。EGFR靶向药物包括EGFR单克隆抗体药西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼。EGFR靶向药物能通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的凋亡。但是，临床试验表明EGFR靶向药物仅对部分肿瘤患者有显著的疗效。进一步的研究发现，肿瘤组织中KRAS基因发生突变(体细胞突变)的肿瘤患者对EGFR靶向药物完全耐药。因此，检测肿瘤患者KRAS基因是否突变成为决定能否使用EGFR靶向药物的必要前提条件。

研究表明约30％的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关，RAS基因家族包括KRAS基因、NRAS基因和HRAS基因等，其中KRAS基因突变比例最大，起开关作用，正常时能调控细胞生长通路，异常时则阻止细胞自我毁灭并导致细胞的生长、增殖和血管生成。而且，由于KRAS基因在EGFR下游，KRAS基因变异细胞不受上游EGFR的信号影响，所以对抗EGFR治疗效果差。

美国国家癌症综合网络(NCCN)明确指出，KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。KRAS基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变频率为15-30％，在人结直肠癌患者中的突变频率为20-50％。导致KRAS基因处于激活状态的突变部位主要是位于第2外显子的密码子12和密码子13，以及位于第3外显子的密码子61。NCCN指出KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使人结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。所以NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶药物作为临床治疗措施。因此KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。检测KRAS基因突变，对判断肿瘤的发生发展均有重要意义：良性肿瘤患者若带有KRAS基因突变，提示有恶变的可能；恶性肿瘤病人若KRAS基因突变阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高。

目前用于基因突变检测的方法有Sanger测序法、高分辨率溶解曲线检测法、高效液相色谱法、ARMS-PCR法等。目前比较常用的是ARMS-PCR法，即扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system ARMS)于1989年建立,该方法灵敏度高，特异性好，但是只可用于对已知突变基因进行检测。Sanger测序法是突变检测的金标准，经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1000bp的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999％。由于具有很高的读取准确率，Sanger测序法成为基因突变、单核苷酸多态性等基因分析的金标准，对未知突变位点也能有效检出。肿瘤组织中，KRAS野生型细胞与突变型细胞混杂，而Sanger测序法的灵敏度仅为10～20％，即当突变型细胞占整体检测细胞的10～20％时才能检出，因此而极大的限制了Sanger测序法的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测人类KRAS基因是否突变。