[发明专利]一种快速高效筛选维生素K2（MK‑7）高产菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速高效筛选维生素K2(MK-7)高产菌的方法，属于生物技术领域。

背景技术

维生素K2是一类脂溶性凝血类维生素，为甲萘醌类系列化合物，根据其分子结构上C-3位异戊二烯侧链的长短不同共有14种形式，以MK-n表示(n指侧链上异戊二烯单位的个数)，甲萘醌-4(MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)最为常见，而MK-7由于可快速被肠道吸收，在血液中的半衰期长等优点被广泛研究。维生素K2在骨质疏松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被称为“第四代抗骨质疏松产品”。除此之外，维生素K2还可以迅速改善由于维生素K缺乏引起的出血，抗动脉钙化及骨关节炎，抗肿瘤，延缓衰老，修复损伤细胞，治疗帕金森症等，广泛地应用于医药、食品等领域。维生素K2的应用已得到了权威机构的认可。2005年日本批准维生素K2作为抗骨质疏松药物上市。我国国家食品药品监督管理局也将维生素K2列入“营养补充剂申报与审评规定(试行)”的“维生素、矿物质化合物名单”中(国食药监注[2005]202号)，可用做保健食品或营养强化剂的原料。2008年1月，维生素K2通过美国食品药品监督管理局(FDA)安全认定。2009年，欧洲议会和欧盟理事会决定在其所有成员国中，维生素K2可用作保健食品或营养强化剂的原料(2009/345/EC)。

目前，国内外维生素K2的专利主要涉及三方面内容，一方面是发酵过程调控的优化(EP1803820B1；CN104357355A)；一方面是维生素K2产物的分离提取(CN103898175A；US20060057688A1)；另一方面是菌种筛选，达能日尔维公司(法国)采用杆菌肽或过氧化物使乳酸菌自然变种(US7981657B2)；上海红马饲料有限公司采用紫外和亚硝基胍复合诱变，结合原生质体融合技术筛选维生素K2高产菌株(CN102827798A)。

目前，工业化生产维生素K2大多是都以化学合成法生产，由于微生物发酵法生产其产量太低，成本过高，无法作为批量生产的主要途径，需要进行诱变筛选提高产量。菌株筛选的方法一般为化学诱变法，物理诱变法，离子注入诱变法和原生质体诱变法等。其中，常压室温等离子体(ARTP)诱变不仅可以对微藻、细菌、真菌、酵母等微生物进行快速诱变，而且由于其正突变率高，与传统诱变方式相比，更容易获得遗传稳定性良好的优良突变菌。在大多数革兰氏阳性细菌中，维生素K2(甲基萘醌类)是细胞内唯一的内源性亲脂抗氧化剂，也是呼吸链中不可或缺的电子传递体。其作用效果和CoQ相似，通过维持线粒体DNA和基因的稳定促进细胞的生存，通过调节细胞线粒体通透性转换孔等起到独立的抗凋亡作用。本发明拟采用ARTP方法对纳豆芽孢杆菌的出发菌株进行诱变，并针对抗反馈突变菌株(结构类似物抗性突变菌)和抗呼吸链抑制剂的菌株的筛选进行了一系列实验，通过对比底物消耗速率、生物量和产量等方面，从而获得高产菌株，为实现维生素K2的微生物发展的工业化奠定基础。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于，现有技术中菌种选育过程效率过低，无法获取高产菌株；为了解决该问题，本发明提供一种快速高效筛选维生素K2(MK-7)高产菌的方法。

具体的，本方案为：

一种快速高效筛选维生素K2高产菌的方法，其中，以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，经常压室温等离子体(ARTP)诱变原始菌株，诱变后的菌株用含维生素K2结构类似物的平板选育后，再在含呼吸链抑制剂的平板上进行选育，并经96孔培养板发酵复筛，获取维生素K2高产菌。

本发明所述的方法，其中，具体步骤为：

(1)将纳豆芽孢杆菌出发菌株在种子培养基中活化；

(2)将灭菌的金属载片置于已灭菌的玻璃平板中，将活化后的纳豆菌菌悬液均匀涂布于载片上，分别在ARTP-II型诱变机中进行诱变；

(3)纳豆菌菌悬液诱变完成后，将其用生理盐水洗脱，并涂布在添加维生素K2结构类似物无菌平板上，挑选出单菌落在96孔培养板中发酵，将维生素K2高产菌株进行保藏；

(4)将步骤(3)获得的纳豆芽孢杆菌活化后，均匀涂布在添加呼吸链抑制剂无菌平板上，挑选出单菌落在96孔培养板中发酵，将维生素K2高产菌株进行保藏。

本发明所述的方法，其中，所述步骤(2)中，常压室温等离子体诱变采用ARTP-II型诱变机，以时间为可变参数，功率设定为100W，气流量设定为10SLM，调整诱变时间为30～150s。