[发明专利]一种疏水性多肽原料的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及强疏水性多肽原料的纯化方法。

背景技术

多肽(Peptide)是具有活性高、起效快、安全度高、副作用小等优点的大分子物质，通过生物表达或者化学合成的多肽药物在抗肿瘤、抗病毒、抗菌、疫苗等领域发挥巨大作用。随着医学及生化技术的发展，多肽类药物将成为21世纪最重要的监测、预防、诊断和治疗药，近年来，世界药物格局有了巨大改变，小分子化药开发越来越难，其所占的市场份额不断被生物制品所蚕食，其中多肽药物发展最为迅猛。目前，全球已批准了近60个多肽产品上市，全球多肽药物的市场已超过200亿美元。所以，多肽的合成和纯化方法研究具有重要的意义。

目前，纯化多肽多采用的是反相制备色谱，由于合成多肽的原料均带有保护基团，例如Fmoc-cys(pal)-OH、Fmoc-asp-AMC等原料，具有强疏水性，水和乙腈不能很好地把粗品溶解，需要加入酸、碱或者DMSO助溶，对反相色谱柱有很大地伤害，大大降低了反相色谱柱的使用寿命。粗品不容易溶解，在纯化尤其大量纯化时，样品吸附到色谱柱上会比较困难。含有保护基的多肽在反相色谱柱(C18、C8、C4)中保留时间太长，不容易被洗脱出来，有可能导致样品在制备中扩散，导致峰型较宽，分离效果差，得率偏低。采用正相系统纯化强疏水性原料，提高了纯化的效率和目标物质的回收率，降低了氨基酸浪费和溶剂消耗。

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种疏水性多肽原料的纯化方法，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种解决了疏水性多肽纯化过程中溶解困难和回收率低的问题的纯化方法。

本发明的疏水性多肽原料的纯化方法，包括多肽原料的溶解、正相色谱柱分析和正相制备色谱柱吸附及洗脱收集的步骤。

进一步的，所述溶解的步骤包括将多肽原料溶解于有机溶剂中得到多肽原料溶液。

进一步的，所述正相色谱柱分析的步骤包括将多肽原料溶液接正相分析色谱柱进行梯度检测，得到分析图谱。

正相分析条件为：

色谱柱为腈基柱，柱子型号为Haobo CN 5μm，4.6*250mm，

其中，流动相：A液：正己烷，B液：异丙醇；

时间：0-20min；

流速：1.00mL/min；

A：B为：99-90:1-10到1-10:99-90；

波长：200-240nm。

在正相色谱柱分析步骤前，先将HPLC反相色谱分析柱换成正相色谱分析柱，包括以下步骤：

(a)卸掉冲洗好的反相色谱柱，连接好双通，用异丙醇冲洗色谱系统10min(流速1-10mL/min)，在此期间空拨进样阀3次。

(b)换正己烷或乙酸乙酯冲洗系统20min(流速1-10mL/min)，在此期间空拨进样阀3次；

(c)装上硅胶色谱柱(还可以是腈基色谱柱或氨基色谱柱)，流速调1-10mL/min，用正己烷冲洗系统，直至系统平衡。

初始梯度平衡色谱分析柱，进样15-25μL进行梯度检测，优选20μL。

所述色谱分析柱的流动相梯度为A:B由99-90:1-10到50-70:30-50。

进一步的，所述制备色谱柱吸附及洗脱收集包括以下步骤：

(1)根据所述分析图谱设置制备色谱柱的制备梯度。

(2)将多肽原料溶液接所述制备色谱柱进行进样吸附并洗脱收集。

(3)收集洗脱出来的所有峰进行质谱确认及产品纯度检测。

正相制备条件为：

色谱柱为腈基柱，柱子型号为Haobo CN 5μm 20*250mm，

其中，流动相：A液：正己烷，B液：异丙醇；

时间：0-40min；

流速：20.00mL/min；

A：B为：99-90:1-10到50-70:50-30；

波长：200-240nm。

产品纯度检测条件为：

色谱柱为C18柱，柱子型号为Innoval ODS-2 5μm4.6*250mm，

其中，流动相：A液：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸水溶液，B液：乙腈；

时间：0-40min；

流速：1.00mL/min；

0-20min A：B为：50-70:50-30到1-10：99-90；