[发明专利]一种聚苯乙烯亲和肽及其用于改善抗原固定效果的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种亲和肽序列PB-TUP，该肽可特异性结合聚苯乙烯材料。以及该肽在改善多肽及蛋白质在聚苯乙烯材料表面固定效果的方法。

背景技术

噬菌体展示技术于1985年由George P.Smith创建，通过将噬菌体工程化改造，在保证其侵染能力和繁殖能力的情况下，使外源氨基酸序列展示于衣壳蛋白末端。通过至少三轮的吸附，洗脱，扩增的生物筛选程序，从众多随机的噬菌体中，富集得到同靶标有特异性亲和能力的噬菌体。通过对噬菌体DNA测序，可鉴定与靶标结合的多肽编码核酸序列，并得到其编码多肽的氨基酸序列。噬菌体展示技术不仅广泛应用于医药领域的基础研究和药物开发，还可应用于材料科学领域，通过筛选获得可与固相材料结合的多肽序列，介导生物分子与非生物材料界面的相互作用。

多肽，尤其是小分子多肽，由于吸附能力很弱，不能直接包被固相材料如聚苯乙烯，用于酶联免疫吸附实验(ELISA)和其他方面的研究。采用经过特殊处理的固相材料，可以提高小分子多肽的吸附，但也会在很大程度上增加成本。人们常将小分子多肽与大分子蛋白如BSA偶联，再包被固相材料，用于检测和研究。这种方法不仅耗时，需多步反应以促使肽和材料结合，而且还存在生物分子在偶联过程中因空间构象改变而导致生物学活性丧失的情况。另外多肽和蛋白质在固相表面的非特异性吸附是无序的，没有方向性，部分蛋白或多肽会因构象改变或活性位点被遮蔽而失去功能，从而影响检测或后续研究的灵敏度和准确性。

聚苯乙烯亲和肽在蛋白质或多肽的固定方面具有优势及应用前景。将亲和肽与目的蛋白或多肽相融合，不仅可以提高多肽或蛋白对聚苯乙烯材料的吸附，还可在不影响构象及活性位点的前提下使多肽或蛋白与固相表面结合，是一种简单易行的定向固定方法。

发明内容

1.发明目的

本发明的目的是为了获得一种同聚苯乙烯材料具有特异性结合作用的多肽序列，以及利用该亲和肽提高多肽及蛋白在聚苯乙烯表面的固定效果。

2.技术方案

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

运用噬菌体展示十二肽库通过生物筛选得到同聚苯乙烯材料具有特异性亲和作用的噬菌体克隆PB-TUP，并通过测序得到展示于该噬菌体表面的多肽序列。

选用不同封闭液与洗涤液，通过酶联免疫吸附实验比较不同实验条件下PB-TUP噬菌体克隆与对照噬菌体克隆(即噬菌体十二肽文库、野生型M13KE噬菌体克隆以及无关肽噬菌体克隆D12)同聚苯乙烯材料的结合能力，验证PB-TUP噬菌体与聚苯乙烯材料结合的特异性。

排除PB-TUP噬菌体与封闭液脱脂牛奶结合导致假阳性的可能性。为了排除假阳性，在酶联免疫吸附试验中使用不同浓度的脱脂牛奶进行封闭。观察PB-TUP的吸附是否随脱脂牛奶浓度的增加而变化。

排除二抗非特异性吸附于聚苯乙烯表面导致假阳性的可能性。酶联免疫吸附实验中的二抗(检测抗体)缀连有HRP，如果封闭不彻底或洗涤过度将导致封闭位点暴露，使二抗非特异性吸附于聚苯乙烯表面，导致假阳性的发生。为了排除假阳性，确认PB-TUP噬菌体与聚苯乙烯的特异性结合，采取以下两个方案进行验证：一、在酶联免疫吸附实验中，在加入二抗前增加封闭步骤，以消除因封闭不足或洗涤过度造成的封闭位点暴露，减少二抗的非特异性吸附；二、洗脱回收与聚苯乙烯结合的噬菌体，进行滴度检测，与酶联免疫吸附实验进行比较以排除假阳性的可能。

排除因噬菌体扩增优势导致假阳性的可能性。扩增时由于噬菌体克隆的生长速率不一，具有增长优势的噬菌体经四轮扩增后可能得到富集。为排除这种可能性，测定PB-TUP噬菌体克隆与对照噬菌体克隆(即噬菌体十二肽文库、野生型M13KE噬菌体克隆以及无关肽噬菌体克隆D12)的扩增曲线。

PB-TUP噬菌体与聚苯乙烯结合的浓度依赖性研究。进行酶联免疫吸附实验以及测定回收噬菌体滴度，检测PB-TUP与聚苯乙烯结合的量效关系。

pH环境对PB-TUP噬菌体克隆与聚苯乙烯结合的影响研究。

PB-TUP多肽改善多肽对聚苯乙烯吸附能力的研究。多肽P2由22个氨基酸组成，是本研究小组前期设计的一种具有内皮细胞粘附功能的多肽，已申报专利(ZL201210258041.1)。P2分子量小，对聚苯乙烯的吸附作用很弱，难以直接包被聚苯乙烯微孔板，进行酶联免疫吸附实验和其他研究。通过固相合成的方法将PB-TUP多肽序列的C末端通过六氨基己酸与P2的N末端相连得到融合肽PB-TUP-P2。通过酶联吸附免疫实验验证亲和肽改善多肽固定化的效果，并与BSA偶联的P2进行比较。