[发明专利]一种高效表达小鼠促性腺激素抑制激素基因的慢病毒载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种高效介导促性腺激素抑制激素基因过表达的慢病毒载体及其应用。

背景技术

促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)是2000年Tsutsui及其同事于日本鹌鸫下丘脑发现的一种含有12个氨基酸的精氨酰-苯丙酰胺(RF酰胺)神经肽，其作用受体为一种G蛋白偶联受体147(GPR147)。GnIH能抑制性腺激素的合成与释放进而调控动物的繁殖，故将其命名为促性腺激素抑制激素。此后，GnIH及其同系物于各类动物中相继被发现，因它们都拥有特征性的C端氨基酸序列LPXRF(X＝L或P)，故被称为RF酰胺相关肽(RFRPs)。GnIH的发现，证明促性腺激素释放激素(gonadotropin inhibitory hormone，GnRH)并不是唯一调节性腺类激素合成与分泌的神经肽，因此在动物繁殖的研究领域，对GnIH功能的研究也逐渐成为一个热点之一。

对于外源基因导入细胞常用的方法有脂质体转染法、电转法以及显微注射法。但是以上方法存在着自身的缺陷，如脂质体转染法对原代和非分裂期细胞转染效率低，电转法对细胞损伤大，显微注射操作难度大等，而且以上几种方法对于转录的基因都无法实现长期稳定的表达。慢病毒载体是一种常用的逆转录病毒，是在由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的基础上改装而来，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞和不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒载体己经成为表达外源基因的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。已有研究表明利用慢病毒在疾病的基因治疗方面发挥重要的作用。

促性腺激素抑制激素作为一种对性腺激素具有抑制作用的调节因子，在一些物种激素调节中有过一些报道，但是构建其慢病毒载体并在小鼠卵泡发育中的作用还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术还没有对小鼠促性腺激素抑制激素基因表达进行调控的产品这一缺陷，提供一种高效表达小鼠促性腺激素抑制激素(简称GnIH)基因的慢病毒载体，同时提供该载体的应用。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种高效表达小鼠促性腺激素抑制激素基因的慢病毒表达载体，该慢病毒表达载体是将小鼠促性腺激素抑制激素基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中构建而成。

本发明同时提供上述慢病毒表达载体在促进小鼠卵巢颗粒细胞促性腺激素抑制激素基因表达中的应用。其中，该应用是指对小鼠卵巢颗粒细胞增殖具有抑制作用；对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素分泌具有抑制作用；对小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡具有促进作用。

本发明具有以下有益效果：本发明构建的慢病毒表达载体能够显著提高小鼠卵巢颗粒细胞GnIH基因的表达，以及对雌激素分泌及颗粒细胞增殖、凋亡均产生重要作用。通过实时定量荧光PCR检测发现，慢病毒表达载体能使GnIH mRNA表达量提高1200倍以上，通过ELSIA检测发现，慢病毒表达载体能使雌激素分泌量降低38.2％，流式细胞技术检测表明，颗粒细胞凋亡升高47.5％。本发明所构建的慢病毒表达载体可制备成基因药物或其他合适的制剂用于调节小鼠促性腺激素抑制激素分泌水平，可应用于调控动物繁殖功能。

附图说明

图1是慢病毒系统质粒图。

其中，A为慢病毒表达质粒，B为慢病毒包装质粒。

图2是GnIH PCR电泳结果图。

其中，1：GnIH，2：M：DL 2000Marker。

图3是pLVX-IRES-ZsGreen1空质粒酶切图。

其中，1：pLVX-IRES-ZsGreen1空质粒，2：EcoR I和BamH I双酶切，M：DL 8000Marker。

图4是pLVX-GnIH菌落PCR检测图。

其中，1-5：pLVX-GnIH菌液，M:DL 2000Marker。

图5是小鼠pLVX-GnIH酶切鉴定电泳图。

其中，1：pLVX-IRES-ZsGreen1空质粒，2：pLVX-IRES-ZsGreen1空质粒EcoR I和BamH I双酶切pLVX-GnIH产物，M1：DL 5000Marker，M2：DL 2000Maker

图6是克隆基因同小鼠GnIH基因对比结果。