[发明专利]黄瓜雄性不育基因、分子标记、筛选方法及其用途

说明书

本发明涉及与黄瓜雄性不育基因相关的SNP和InDel标记及其筛选方法，并根据这些标记筛选获得了黄瓜雄性不育基因。具体地，筛选方法包括如下步骤。(1)配置群体；(2)建库测序；(3)分离群体分组分析(BSA)和(4)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)，精细定位不育基因，并得到与不育性状紧密连锁的SNP或InDel位点。该雄性不育基因的获得为快速鉴定黄瓜雄性不育性植株和黄瓜杂交种的高效生产提供了有效的工具。

技术领域

本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体地说，涉及与黄瓜雄性不育基因相关的SNP或InDel的标记，及其筛选，以及获得的雄性不育基因及它们在鉴定雄性不育植株的用途。

背景技术

目前在其他作物上定位了很多雄性不育基因，并开发了很多与雄性不育基因紧密连锁的标记，但在在黄瓜上雄性不育基因的报道很少，更谈不上应用。此外，目前利用最多的是核质互作不育系、光敏不育系及温敏不育系等，对核不育基因的利用很少，主要是因为难以找到保持系。传统上基因定位的方法是利用已有的分子标记，分离群体中大量的筛选差异条带，定位基因太过耗时耗力。

虽然专利申请CN105420408A对黄瓜不育基因的分子标记进行了探索，但是其只获得了一个SNP标记，并且该SNP标记过于单一，不能定位黄瓜不育基因。

发明内容

在本申请的一个实施方案中，本申请涉及一种获得植物雄性不育分子标记SNP或InDel标记和定位雄性不育基因的方法。所述方法包括以下步骤：

（1）配置群体：将植物雄性不育系作为母本与可育远缘品种为父本进行杂交，得到杂种F1，由杂种F1自交得到F2代分离群体，F2代分离群体中存在雄性可育和雄性不育两种表型；

（2）建库测序：提取母本、父本、F2代中可育单株和不育单株的基因组DNA并分别混合形成4个混池即母本池、父本池、可育池及不育池，对各混池的基因组DNA进行双末端测序，对测序得到的读段用BWA软件与正常黄瓜基因组比对，基于比对的结果，使用GATK软件进行SNP的检测和注释；

（3）分离群体分组分析（BSA）：根据测序获得的SNP的检测结果，计算可育池与不育池的Δ（SNP-index）值，采用Δ（SNP-index）值的99%的置信区间，来确定目标基因所在区域。其中SNP-index指某个染色体位点含有SNP的读段数与测到的该位点的总读段数的比值， Δ（SNP-index) 指可育池与不育池的SNP-index值之差（Takagi 等人，2013）；

（4）竞争性等位基因特异性 PCR (KASP)：针对候选区间内选取的候选SNP 位点设计SNP 分型引物在938株F2群体中进行KASP分型，得到与不育性状紧密连锁的SNP或InDel位点；

（5）根据KSAP分型结果构建遗传图谱，定位雄性不育基因。

本研究引入了一个SNP位点的测序深度相关的参数SNP-index，该参数是指某个位点含有SNP的读段数与测到该位点的总读段数的比值，大小范围为0-1。若该参数为0，代表所有测到的读段都来自被用作参考基因组的那个亲本的基因组；该参数为1，代表所有读段都来自另一个亲本；该参数为0.5，则代表此混池中SNP来自两个亲本的基因组的频率一致。将两个池观测到的SNP都计算出SNP-index，然后将两个池的SNP-index值相减后得到Δ(SNP-index)，将Δ(SNP-index)对应该SNP所在染色体位置作图，采用Δ（SNP-index）值的99%的置信区间筛选雄性不育基因候选区域。针对Δ(SNP-index)再做零假设，得出相应的p值，用于检验该数值的可信度，一般p＜0.05才认为有统计学意义。

在本发明的一个实施方案中，所述植株是黄瓜。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记是SNP标记。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记是InDel标记。